РАСПРЕДЕЛЕНИЕ РЕЦЕПТОРОВ ИНСУЛИНОПОДОБНОГО ФАКТОРА РОСТА-I (ИФР-I) И ИНСУЛИНА В КЛЕТКЕ ПРИ ИХ ЭНДОЦИТОЗЕ - КЛЮЧЕВОЕ ЗВЕНО В ФОРМИРОВАНИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ РОЛИ ИФР-I И ИНСУЛИНА В ОРГАНИЗМЕ.

Колычев А. П., Терновская Е. Е. Федеральное государственное бюджетное учреждение науки. Институт эволюционной физиологии и биохимии им И.М. Сеченова, РАН, Санкт Петербург.

Ключевые слова: гепатоциты, инсулин, ИФР-I, рецепторы, интернализация, эндоцитоз, температура, функциональная роль.

E-mail - kolap@iephb.ru

Центральное значение инсулина, как метаболического гормона в поддержании баланса глюкозы в крови, в организме сочетается с анаболическим его действием, представленным широким спектром эффектов, условно разделяемых на основные - метаболические (стимуляция транспорта глюкозы и аминокислот в клетку, синтеза гликогена, жиров, белков) и отставленные - митогенные: усиление клеточного деления и синтеза нуклеиновых кислот. Вся палитра действия инсулина обеспечивается взаимодействием гормона с инсулиновым рецептором (ИР) на плазматической мембране [1,2].

Множественные эффекты инсулина после его связывания с ИР, обеспечиваются фосфорилированием тирозинкиназы ИР ведущим к каскаду реакций фосфорилирования субстратов белков-посредников. Особое место среди посредников занимают: ИРС-1, расположенный преимущественно премембранно, и пептид Shc, локализованный в цитоплазматических компартментах клетки. Через фосфорилирование ИРС-1 - начальный этап передачи сигнала с активацией серии премембранных посредников, реализуются разнообразные метаболические эффекты, дальнейшее фосфорилирование Shc приводит главным образом к реализации митогенного действия инсулина [3,4]. Наряду с инициацией гормонального сигнала взаимодействие инсулина со специфическим рецептором запускает эндоцитоз ИР и тем самым интернализацию в клетку инсулин/рецепторного комплекса (ИРК).

Как клеточный механизм, регулирующий уровень влияния гормона на клетку, интернализация ведёт: к погружению в цитоплазму инсулина в составе комплекса, к частичной диссоциации его из комплекса в ранних эндосомах с последующей деградацией в лизосомах, либо к возвращению в составе функционирующего гормон/рецепторного комплекса (ГРК) на клеточную поверхность [3]. Установлена зависимость фосфорилирования Shc, а также действия ИРС-1 в цитозоле от интернализации ИРК [3-7]. Важной особенностью интернализации инсулина является её температурная зависимость. Подавление интернализации инсулина при низкой температуре (4⁰С) вызывает блокаду фосфорилирования Shc, нарушение действия ИРС-1 в цитоплазме при неизменном фосфорилировании премембранного ИРС-1 [3-8].

Структурно родственный инсулину пептид - ИФР-I, связываясь со структурно и функционально родственным рецептору инсулина тирозинкиназным рецептором ИФР-I, in vitro вызывает принципиально ту же разновидность метаболических и митогенных эффектов, что и инсулин. Активация тирозинкиназы ИФР-I рецептора связавшимся с ним ИФР-I ведёт к фосфорилированию тех же внутриклеточных посредников ИРС-1 и Shc, что и активация ИР, но в несколько иной количественной пропорции. Некоторые количественные отличия в сигналинге не позволяют, тем не менее, объяснить иную физиологическую роль этого гормона in vivo. Основное гормональное значение ИФР-I, помимо указанной активности и контроля над апоптозом, состоит в регуляции роста организма как в качестве посредника действия гормона роста, так и самостоятельным определением размеров тела и органов [1-3, 9-11].

Структурное родство самих гормонов - инсулина и ИФР-I, их рецепторов, сходные черты в механизме передачи гормонального сигнала никак не предполагают столь кардинальной разницы функциональных ролей двух родственных пептидов в организме [3]. Проблема, как физиологическая имеющая сама по себе принципиальное значение, кроме того, тесным образом связана с важнейшими направлениями клинической практики: лечением диабета и злокачественных новообразований [3]. Наличие проблемы свидетельствует о серьёзном пробеле в представлении современной эндокринологии по вопросу о формировании в организме функциональной роли инсулина и ИФР-I и указывает на недостаточную изученность каких-то важных звеньев механизма действия обоих гормонов. Среди нескольких гипотез, предлагающих объяснения различия функциональных ролей инсулина и ИФР-I в организме, всё больше внимания уделяется процессингу внутри клетки их ГРК. Несмотря на множество уже известных особенностей во внутриклеточных механизмах действия двух родственных гормонов, убедительного объяснения обособленности их функциональных ролей нет. Поэтому вопрос об отличительных чертах интернализации инсулина и ИФР-I по-прежнему в центре внимания и обсуждается в литературе [3, 14].

С целью выяснения различий основных этапов интернализации ГРК, образованных двумя родственными лигандами, на одном объекте (изолированных гепатоцитах крыс) одновременно прослежены временная и температурная зависимости интернализации стимулируемой инсулином и ИФР-I. Оценка динамики интернализации ¹²⁵I-инсулина и ¹²⁵I-ИФР-I на изолированных гепатоцитах крыс при температурах 37 и 12⁰С, а также анализ распределения меченых гормонов в ходе процесса позволили установить, что каждый из лигандов - инсулин и ИФР-I, запускал специфичный для него механизм эндоцитоза рецепторов. Важное место в специфичности каждого из механизмов занимала разная их температурная зависимость [7,8]. Существенные различия механизмов интернализации инсулина и ИФР-I подчёркивали также присущие каждому из них феномены, отсутствующие в механизме интернализации гормона родственного. Для инсулина - это явление парадоксального «торможения интернализации» при низкой температуре, а для ИФР-I - явление «избыточного накопления» внутриклеточной метки. Особое же значение в различии интернализации инсулина и ИФР-I имело специфическое в каждом случае распределение меченых лигандов по отделам клетки [12,13].

На изолированных гепатоцитах крыс вся последовательность событий в ходе интернализации приводила в конечном итоге к различию локализации ГРК двух меченых гормонов. Так, если при 12⁰С доля интернализованных в клетке ИРК (2,7±0,16%) уменьшалась на 40% относительно доли внутриклеточного ¹²⁵I-инсулина при 37⁰С (4,7±0,6%) (p<0.03), а относительная доля внутриклеточных ИФР-I/рецепторных комплексов оставалась высокой (5.1±0.4%, от 6.4±0.4% при 37⁰С (p>0.05)), то на мембране уровень ИРК уверенно возрастал (до 10,5±0,6%, с 7,4±0,5% при 37⁰С, (p<0.008)), а уровень ИФР-I/РК менялся незначительно [12,13]. Возникало парадоксальное соотношение мембранных и внутриклеточных комплексов. При уровне ИФР-I/РК на мембране в два раза меньшем (5,0±0,4%) чем ИРК (10,5±0,6%), внутри клетки ИФР-I/РК концентрировалось почти в два раза больше последних, т. е. при равном уровне рецепторного связывания (10,5%) ИФР-I и инсулина на мембране, превышение доли ИФР-I/РК внутри клетки (10,8% против 2,7%) являлось четырёхкратным. Несомненно, подобное заметное различие эндоцитоза должно иметь серьёзные последствия для передачи гормонального сигнала (Таблица).

Специфические черты эндоцитоза рецепторов инсулина и ИФР-I, выявленные в работе, а главным образом скопление в результате эндоцитоза их ГРК в разных отделах клетки, позволяют высказать предположение о привязанности механизма действия инсулина и ИФР-I к разным формам сигналинга: первого к мембранной, а последнего к цитозольной. Тогда задержка и накопление при 12⁰С на плазматической мембране функционирующих ИРК должны вести к росту в основном фосфорилирования ИРС-1, в то время как скопление в цитозоле ИФР-I/РК, к усиленному фосфорилированию – Shc.

По-видимому, разное распределение ИРК и ИФР-I/РК по отделам клетки служит ключевым звеном в выборе направления специфического сигналинга для каждого гормона. В таком случае это звено, а также отличительные особенности эндоцитоза рецепторов инсулина (резкое замедление процесса при 12⁰С) и ИФР-I (слабая чувствительность к низкой температуре), реализуя имеющуюся в клетке раздельную локализацию ИРС-1 вблизи мембраны, а Shc в цитозоле и дифференцированную ответственность каждого из посредников за свой участок биологической активности в спектре биологических эффектов двух родственных гормонов, тем самым формируют различие функциональных ролей инсулина и ИФР-I.

УРОВЕНЬ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ¹²⁵I- ИНСУЛИНА И ¹²⁵I-ИФР-I

В ИЗОЛИРОВАННЫХ ГЕПАТОЦИТАХ КРЫС ПРИ 37 И 12⁰С

	37^0С		12^0С
	^125I^-инсулин	^125I^-ИФР-I	^125I-инсулин	^125I^-ИФР-I
Уровень специфического связывания в (%) на 0,6х10^6. клеток/мл	7,4±0,5	6,2±0,4	10,5±0,6	а 5,0±0,4	б 10,5*
Доля интернализо- ванного лиганда в (%) на 0,6х10^6. клеток/мл	4,7±0,6	6,4±0,5	2,8±0,16	5,1±0,4	10,8*

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

[1] Колычев А.П. Инсулиноподобный фактор роста II (ИФР-II). Место среди регуляторных пептидов суперсемейства инсулина // Ж. эвол. биохим. и физиол., 2000, Т. 36, С. 69-82.

[2] Колычев А. П. Структурная организация связывающих детерминант в молекуле инсулиноподобного фактора роста I (ИФР-I) // Ж. эвол. биохим. и физиол. 2010. Т. 46. N 1. С. 74 – 93.

[3] Foti M., Moukil M. A., Dudognon P., Carpentier J-L. Insulin and IGF–I receptor trafficking and signaling // in Navartis Foundation Symposium 2004.V. 262: Biology of IGF-I: Its interaction with insulin in health and malignant states. P. 125-147.

[4] Zick Y. Molecular basis of insulin action // in Navartis Foundation Symposium 2004. v. 262, Biology of IGF – 1: its interaction with insulin in health and malignant states. P. 36 – 55.

[5] Smythe E., & Warren G. The mechanism of receptor-mediated endocytosis // Eur. J. Biochem. 1991. V. 202. P. 689-699.

[6] Sonne O. Receptor-mediated endocytosis and degradation of insulin. Physiol. Reviews. 1988. V. 68. N 4. P. 1129 – 1196.

[7] Maggi D., Andraghetti G. Carpentier J-L. and Cordera R. Cys⁸⁶⁰ in the extracellular domain of insulin receptor β-subunit is critical for internalization and signal transduction // Endocrinology. 1998. V. 139. P. 496-514.

[8] Lappova Y.L., and Leibush B.N. Receptor-Mediated Endocytosis of Insulin in Lower Vertebrates: Internalization and Intracellular Processing of ¹²⁵I-insulin in Isolated Hepatocytes of Lamprey and Frog // General and Comparative Endocrinology. 1995. V 100. P. 1-9.

[9]] Prager D., Li H-L., Yamasaki H. and Melmed S. Human insulin-like growth factor I receptor internalization // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. N 16. P. 11934-11937.

[10] Chow J. C., Condorelli G. and Smith R. Insulin-like growth factor-I internalization regulates signaling via the Shc/mitogen activated protein kinase pathway, but not the insulin receptor substrate-1 pathway // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. N 8. P. 4672-4680.

[11] Lin F-T., Daaka Y. and Lefkowitz R. J. β–Arrestins regulate mitogenic signaling and clathrin-mediated endocytosis of the insulin-like growth factor I receptor // J. Biol. Chem. 1998. V. 273, N 48. P. 31640-31643.

[12] Колычев А.П., Терновская Е.Е., Арсеньева А.В., Шапкина Е.В. Различия динамики интернализации рецепторов инсулина и инсулиноподобного фактора роста-I (ИФР-I) в изолированных гепатоцитах крыс // Ж. эвол. биохим. физиол. 2011 (принято в печать).

[13] Колычев А.П., Терновская Е.Е. Особенности распределения ¹²⁵ I-инсулина и ¹²⁵I-инсулиноподобного фактора роста-I (ИФР-I) при интернализации в изолированных гепатоцитах крыс // Ж. эвол. биохим. физиол. 2012 (принято в печать).

[14] Leibush B.N. Lappova Y. L., Bondareva V. M., Chistyacova O. V., Gutierrez J. and Plisetskaya E. M. Insulin-family peptide-receptor interaction at the early stage of vertebrate evolution.