Боровский Б.В., Шабардина Д.Д., Головань А.В.

Пятигорская государственная фармацевтическая академия, Россия

Разработка ТСХ анализа для контроля чистоты и стабильности «Фенигаммы»

Сотрудниками кафедры органической химии Российского Государственного Педагогического Университета имени А. И. Герцена (г. Санкт–Петербург) было синтезировано новое производное γ-аминомасляной кислоты: 4-амино-3-(пиридил-3)-бутановой кислоты дигидрохлорид («Фенигамма»). Исследования, проведенные фармакологами Волгоградского государственного медицинского университета, показали высокую нейропротекторную и ноотропную фармакологическую активность «Фенигаммы». На кафедре фармацевтической химии ПятГФА в настоящее время разрабатывается НД контроля качества данного фармакологически активного соединения. Целью настоящего исследования явилась разработка методики контроля чистоты и стабильности субстанции анализируемого вещества методом хроматографии в тонком слое сорбента (ТСХ). Объектами исследования являлись стандартные и исследуемые образцы «Фенигаммы» , а так же субстанция продукта полусинтеза γ–пирролидон. Так же, в работе использовали субстанции «Фенигаммы», подвергнутые термостатированию при 105°С в течение 10 суток.

Хроматографирование осуществляли восходящим способом на готовых пластинках «Silufol», имеющих флуоресцентный индикатор (УФ-254), в условиях насыщенной хроматографической камеры. Пробы анализируемых веществ наносили с помощью автоматической установки УСП–1М. Длина пробега фронта растворителя составляла 10,0см. Для обнаружения пятен «Фенигаммы» и γ–пирролидона использовали пары йода и УФ-свет при длине волны 254 нм и 1% раствор нингидрина в спирте этиловом 95% [1,3].

На первом этапе работы нами был осуществлен выбор оптимальной системы растворителей для разделения «Фенигаммы» и γ–пирролидона, а также возможных продуктов их деструкции. Для этого изучили их хроматографическую подвижность в растворителях различной полярности. В результате было установлено, что «Фенигамма» обладает подвижностью в присутствии полярных растворителей – этанола 95%, воды (значения R_f при этом составляли соответственно 0,12±0,04 и 0,40±0,02). В малополярных растворителях (этилацетате, бутаноле, хлороформе, диэтиловом эфире, уксусной кислоте, гексане, бензоле) значения R_f «Фенигаммы» не превышали 0,05. Следовательно, в систему растворителей должны входить полярные жидкости, на основание полученных нами результатов, а так же литературных данных, были составлены четыре системы содержащие спирт этиловый 95% и воду.

Для достижения оптимального разделения были составлены системы растворителей, содержащие спирт этиловый 95% и воду в различных соотношениях 6:4(I); 9:1(II); 7:3(III); 1:1(IV). В таблице 1 представлены результаты определения средних значений R_f «Фенигаммы» и γ–пирролидона с отклонением ±0,05 из десяти параллельных определений.

Таблица 1 – Результаты определения хроматографической подвижности

«Фенигаммы» и γ-пирролидона

	Соотношение этанола 95% и воды, ч.
Rf	(I)	(II)		(III)		(IV)
	6:4		9:1		7:3	1:1
«Фенигаммы»	0,37		0,18		0,45	0,20
γ-пирролидона	0,19		0,10		0,20	0,16

Оптимальной можно считать систему этанол 95% - вода (7:3),так как значение R_f составляет 0,45 и 0,20 для «Фенигаммы» и γ-пирролидона соответственно. Следующим этапом исследований явился выбор оптимального проявителя и установление пределов обнаружения «Фенигаммы» и γ-пирролидона. Учитывая структуру анализируемых веществ и их реакционную способность в качестве проявителя возможно использовать 1% раствор нингидрина в спирте, пары йода (йодная камера), облучение УФ–светом с λ=254 нм[3]. Предварительные испытания показали, что при использовании паров йода появляются пятна темно – коричневого цвета, в УФ–свете проявляется, только пятно соответствующее «Фенигамме», окрашенное в яркий фиолетовый цвет. После обработки, пластинки 1% раствором нингидрина в спирте и нагревания ее в сушильном шкафу в течение 5мин при 80–90°С проявляются «Фенигамма» в виде сине–фиолетового, так и γ-пирролидон – желтого пятна. Для установления пределов обнаружения на пластинку наносили 100; 50; 40; 30; 20; 10; 5; 1; 0,5 мкг исследуемых веществ и хроматографировали в выбранных условиях.

В результате эксперимента установили, что наиболее чувствительным проявителем является 1% спиртовой раствор нингидрина. Предел обнаружения «Фенигаммы» составляет – 0,5 мкг, а для γ-пирролидона – 1 мкг.

На следующем этапе исследования была проведена апробация выбранных условий хроматографирования для определения потенциальных продуктов деструкции «Фенигаммы». Для этого на пластинки наносили 200 мкг образца «Фенигаммы» подвергнутого термическому разложению и в качестве веществ свидетелей 200 мкг γ-пирролидона и «Фенигаммы» по 200 мкг. После хроматографирования пластинки высушивали в горячем потоке воздуха до полного удаления растворителей. Хроматограммы обрабатывали 1% раствором нингидрина в спирте. Пластинку выдерживали в сушильном шкафу при 80–90°С в течение 5 минут. На хроматограмме «Фенигаммы» подвергнутого деструкции проявляется два пятна, с R_f=0,45±0,05 и R_f=0,20±0,02, это позволяет предположить, что продуктом деструкции «Фенигаммы» является γ-пирролидон.

На следующем этапе исследования нами были определена возможность использования для исследований, наряду с пластинками «Silufol» и других хроматографических пластинок с готовым носителем [2,3]. Сравнение проводили на двух типах пластинах марки «Silufol» и «Сорбфил» с алюминиевой подложкой, по параметрам: величина R_f, R_s, время хроматографирования. Результаты проведенного эксперимента представлены в таблице 2.

Таблица 2 – Результаты выбора оптимального типа пластинки

Тип пластинки	Значение Rfср		Значение Rs	Время хроматографирования, ч
	«Фенигамма»	γ-пирролидона
Silufol	0,45±0,05	0,20±0,05	2,25	3,0±0,3
Сорбфил	0,37±0,05	0,19±0,05	1,94	3,3±0,5

Из данных табл. 2 следует, что наиболее целесообразно использовать пластинки типа Silufol.

Проведенные исследования позволили предложить методику контроля чистоты субстанции «Фенигамма»: 0,1г анализируемого вещества растворяют в 10 мл этанола 95% в течение 2-3 минут. На линию старта хроматографической пластинки «Silufol» (или аналогичной) наносят 50 мкл (500 мкг) полученного раствора порциями по 0,2мкл. В качестве свидетелей на пластинку наносят 50 мкл (500 мкг) раствора стандартного образца «Фенигаммы» и 1мкл 0,15%-го раствора γ-пирролидона (1мкг). Пластинку высушивают на воздухе и помещают в камеру насыщенную парами растворителей: этанол 95% - вода (7:3) и хроматографируют восходящим методом. Когда фронт растворителей пройдет 10см от линии старта, пластинку вынимают из камеры, сушат в горячем потоке воздуха. Высушенную пластинку опрыскивают 1% спиртовым раствором нингидрина и выдерживают в сушильном шкафу при температуре 80-90°С в течение 5 мин. На хроматограмме испытуемого образца должно наблюдаться не более двух пятен, по величине R_f соответствующие пятнам образцов свидетелей. Пятно соответствующее γ-пирролидону в испытуемом веществе по величине и интенсивности не должно превышать пятна свидетеля.

Таким образом, изучена хроматографическая подвижность «Фенигаммы», выбрана система растворителей этанол 95% - вода (7:3), позволяющая достоверно разделить и определить «Фенигамму» и продукт его деструкции. Разработана методика, позволяющая осуществлять контроль чистоты и стабильности «Фенигаммы».

Библиографический список

1. Гейсс, Ф. Основы тонкослойной хроматографии (планарная хроматография) / Ф.Гейсс // Т. 1,2. Пер. с англ. – М.: Мир, 1999. – 611с.

2. Аналитическая хроматография / Сакодынский К.И..- М.: Мир, 1993. –714 с.

3. Кирхнер, Ю.Тонкослойная хроматография. Пер.с англ.: в 2 т. / Ю. Кирхнер. - М.:Мир, 1981. –1135с.