К.б.н. Лабутова Н.М., Ломтева Н.А.

Санкт-Петербургский государственный университет, Россия

Видовой состав бактерий-нефтедеструкторов, выделенных из дерново-подзолистой почвы, загрязненной нефтью

Восстановление почвы после нефтезагрязнения связано, прежде всего, с деятельностью почвенной микрофлоры, способной потреблять углерод из циклических углеводородов. Знания о качественном составе микробиоты, участвующей в разложении нефти в почве, позволяют более целенаправленно проводить поиск микроорганизмов для создания биопрепаратов, используемых для очистки загрязненной нефтью почвы. С другой стороны, представления о составе и, соответственно, биологии нефтедеструкторов, необходимы для разработки мероприятий, способствующих активизации их деятельности в загрязненной почве. Видовой состав микроорганизмов, разлагающих нефть, исследован во многих типах почв на территории России, но о таксономическом составе этой группы микроорганизмов в дерново-подзолистых почвах известно крайне мало.

Целью настоящей работы было изучение видового состава бактерий-нефтедеструкторов в дерново-подзолистой почве, загрязненной нефтью.

Исследования проводили в Ленинградской области на хорошо окультуренной дерново-подзолистой суглинистой почве на карбонатной морене (по новой классификации - агро-дерново-подзолистая среднесуглинистая на карбонатной морене). В условиях полевого эксперимента в почву делянок вносили сырую нефть в количестве 3 л/м² (2,9% по С) и засевали овсяницей.

Для выделения бактерий-нефтедеструкторов был применен разработанный нами метод «ловушек», основанный на использовании мембранных фильтров, пропитанных нефтью. Такой фильтр, будучи помещен в почву, является приманкой, для микроорганизмов, способных использовать циклические углеводороды в качестве источника углерода. В ходе проводимых исследований, с делянок полевого опыта осенью были отобраны образцы почвы массой 600 г и помещены в пластиковые сосуды. В сосуды с почвой вводили пропитанные нефтью мембранные фильтры и инкубировали 30, 60 и 90 суток. На протяжении всего эксперимента влажность почвы поддерживалась на уровне 60% от полной влагоемкости, а температура составляла 22-24⁰С. По окончании срока инкубации делали смыв с фильтров с последующим поверхностным высевом на МПА. Выросшие колонии анализировали визуально по морфологическим признакам и все морфолого-культуральные типы выделяли в чистые культуры. Предварительно оценивали численность каждого морфолого-культурального типа и рассчитывали его обилие в % от общей численности бактерий. Идентификацию выделенных штаммов проводили по их биохимическим признакам (Хоулт, Криг, 1997; Возняковская, 1985).

Для проверки способности бактерий разлагать нефть использовали разработанный нами экспресс-метод. Суть метода заключается в создании условий, когда нефть является для микроорганизмов единственным источником углерода. Для этого мембранные фильтры пропитывали стерилизованной нефтью и раскладывали на твердую питательную среду без углерода. На поверхность мембранных фильтров производили посев чистых культур микроорганизмов, выделенных из «ловушек». Об активности нефтедеструкции судили по размеру сформированных колоний, который оценивали в баллах.

Оценка численности прокариот в «ловушках» показала, что количество бактерий-нефтедеструкторов через 30 суток инкубации достигло 48,2·10⁵/см², а затем плавно снижалось в течение эксперимента и через 90 суток составило 11,4·10⁵/см². По-видимому, это связано, с одной стороны, с формированием на фильтрах бактериоценоза, включающего специализированные виды. С другой стороны, в первую очередь, окислялись наиболее легкогидролизуемые фракции нефти, доступные в качестве питательного субстрата многим видам быстро растущих бактерий. В результате, через 90 суток инкубации на фильтрах остались трудногидролизуемые фракции, которые способны разлагать немногочисленные и медленно растущие прокариоты.

Определение видового состава показало, что среди бактерий-нефтедеструктуров, выделенных из дерново-подзолистой почвы присутствовали виды родов Bacillus, Arthrobacter, Flavobacterium, Xanthomonas, Brevibacterium и Nocardia (Табл. № 1). Следует отметить, что при изучении таксономического состава бактерий-нефтедеструкторов в других типах почв, чаще всего выделяются представители именно этих родов (Киреева и др., 2001; Гузев и др., 1989; Квасников, Клюшникова, 1981). Таким образом, полученные нами результаты согласуются с данными других исследователей, хотя, в дерново-подзолистой почве присутствует специфический набор видов, относящихся к вышеперечисленным родам.

Табл. № 1. Качественный и количественный состав бактерий-нефтедеструкторов, выделенных из «ловушек».

Вид	Обилие вида, %
	30 суток	60 суток	90 суток
Arthrobacter simplex	88,3	0	0
A. mysorens	0,7	0	4,4
Brevibacterium fuscum	11,0	0	0
Flavobacterium solare	0	42,7	0
F. fucatum	0	5,6	0
Bacillus sp., шт. 6	0	32,6	0
B. mycoides	0	1,1	2,9
Xanthomonas oryza	0	18,0	0
Nocardia minima	0	0	85,3
B. megaterium	0	0	7,4

Исследование таксономической структуры бактерий-нефтедеструкторов в динамике показало сукцессию видов в «ловушках». Имела место четкая смена доминант: через 30 суток доминировали виды р. Аrthrobacter, через 60 суток – р. Flavobacterium, а через 90 – р. Nocardia (Табл. № 1). К концу инкубации в «ловушках» доминировали бактерии Nocardia minima, которые известны своей способностью разлагать наиболее труднодоступные соединения углерода, в том числе и трудногидролизуемые фракции нефти.

Сукцессионные изменения хорошо согласуются с результатами проверки активности нефтедеструкции исследуемых штаммов. Хотя все выделенные бактерии проявляли высокую способность к разложению нефти, явно прослеживалась тенденция к увеличению активности нефтедеструкции у видов, накапливающихся в «ловушках» к концу эксперимента (Табл.№ 2). Следует отметить, что наибольший способностью к нефтедеструкции в дерново-подзолистой почве обладали представители родов Nocardia, Аrthrobacter, Xanthomonas и Bacillus.

Табл. № 2. Способность к нефтедеструкции бактерий, выделенных из «ловушек».

Вид	Активность нефтедеструкции, баллы
30 суток инкубации
Аrthrobacter mysorens	2
Аrthrobacter simplex	2
Brevibacterium fuscum	1
60 суток инкубации
Flavobacterium solare	3
Flavobacterium fucatum	2
Bacillus sp., шт.6	3
Bacillus mycoides	1
Xanthomonas oryza	2
90 суток инкубации
Nocardia minima	3
Bacillus mycoides	3
Bacillus megaterium	3
Аrthrobacter mysorens	3

Литература:

1. Квасников Е.И., Клюшникова Т.М. Микроорганизмы - деструкторы нефти в водных бассейнах. Киев: изд-во «Наукова думка». 1981. 132с.

2. Киреева Н.А., Водопьянов В.В., Мифтахова A.M. Биологическая активность нефтезагрязненных почв. Уфа: изд-во «Гилем». 2001. 376с

3. Гузев В.С., Левин С.В., Селецкий Г.И., Бабьева Е.Н., Калачникова И.Г., Колесникова Н.М., Оборин А.А., Звягинцев Д.Г. Роль почвенной микробиоты в рекультивации нефтезагрязненных почв//Микроорганизмы и охрана почв. М.: изд-во МГУ, 1989. С. 121-150.

4. Возняковская Ю.М. Попова Ж.П. Методические указания по идентификации неспоровых бактерий, доминирующих в ризосфере растений. Л.: изд-во ВНИИСХМ. 1985. 104 с.

5. Хоулт Дж., Криг Н. Определитель бактерий Берджи. М.: изд-во «Мир», 1997. 440 с.