Анохина Е. П., Гриценко А. С., Корнеева О. С.

ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий», Россия

ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОЕ конструирование

ПРОДУЦЕНТА β-маннаназЫ

В последнее время особый интерес вызывают β-маннаназы – ферменты, расщепляющие полисахариды гемицеллюлозной фракции клеточной стенки растений - маннаны. Продукты ферментативного гидролиза – манноза и манноолигосахариды проявляют ярко выраженное бифидогенное и иммуностимулирующее действие [1, 2, 3]. Актуальным направлением является создание на основе гидролизатов маннана лечебно-профилактических средств с иммуномодулирующими свойствами [4, 5].

Способность к биосинтезу β-маннаназ проявляют микроорганизмы различных таксономических групп, однако уровень продукции фермента в них выражен не достаточно [6]. Достижения в области молекулярного клонирования позволяют получать микроорганизмы с заданными генетическими свойствами и повысить выход целевого фермента по сравнению с нативным продуцентом.

Выбор бактериальной культуры в качестве источника гена β-маннаназы и системы экспрессии обусловлен необходимостью успешной экспрессии гена в клетках организма-хозяина, доступностью генетических манипуляций для внесения изменений в бактериальный геном, быстрым ростом бактериальных продуцентов.

В результате скрининга штаммов рода Bacillus из коллекции микроорганизмов ВКПМ ГосНИИгенетика в качестве источника целевого гена β-маннаназы был выбран штамм Bacillus subtilis 168, обладающий достаточно высокой активностью и известной нуклеотидной последовательностью гена β-маннаназы (табл. 1).

Таблица 1

β-Маннаназная активность отобранных штаммов рода Bacillus

Наименование культуры	Активность β-маннаназы, ед/см^3
B. macerans B-2692	112
B. subtilis 168 В-1727	106
B. licheniformis B-2985	79
B. sp. B-5880	107

Для амплификации гена β-маннаназы B. subtilis использовали ПЦР, для клонирования фрагментов ДНК - вектор pBlueScript ks (+), в качестве репликативного вектора - pCB20 (рис. 1).

Рис. 1. Генетическая карта плазмидного вектора pСВ20

На основе репликативного вектора pСВ20 получены 2 генетические конструкции, содержащие ген β-маннаназы под контролем разных промоторов, способные автономно реплицироваться в клетках В. subtilis и экспрессировать целевой ген. В результате исследования экспрессии гена β-маннаназы под контролем различных промоторов определен промотор, обеспечивающий наиболее интенсивную транскрипцию гена β-маннаназы.

В результате трансформации конструкцией на основе вектора pCB20 получен рекомбинантный штамм В. subtilis, активно продуцирующий β-маннаназу и превышающий уровень активности нативного продуцента более чем в 20 раз.

ЛИТЕРАТУРА

1. Корнеева О.С. Пребиотические свойства маннозы и ее влияние на специфическую резистентность. [Текст] / О.С. Корнеева, А.С. Глущенко, И.В. Черемушкина // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2012. - № 5. - С. 51-57.

2. Черемушкина И.В. Оптимизация ферментативного гидролиза трудногидролизуемых маннанов и исследование пребиотических свойств маннозы [Текст] / И.В. Черемушкина, А.С. Глущенко, Е.П. Анохина, Н.А. Чигирина, Д.А. Черенков, А.А. Слепокуров, Н.А. Михайлова, О.С. Корнеева // Биотехнология. – 2010. - № 5 – С. 56-61.

3. Анохина Е.П. Исследование пребиотической активности гидролизатов маннана в условиях in vitro [Текст] / Е.П. Анохина, О.С. Корнеева, И.В.Черемушкина, П.В. Шуваев // Вестник ВГУИТ. – 2013. - № 4. – С. 216-219.

4. Черемушкина И.В. Роль биомодифицированных кормов в повышении качества продукции перепеловодства [Текст] / И.В. Черемушкина, Н.А. Чигирина, Е.П. Анохина, О.С. Корнеева // Вестник Воронежской государственной технологической академии. - 2010. – Т. 45, № 3. – С. 82-84.

5. Martín Hernández, E. Congenital disorder of glycosylation type 1b. Experience with mannose treatment / E. Martín Hernández, A.I. Vega Pajares, B. Pérez González, M.J. Ecay Crespo, F. Leal Pérez, J. Manzanares López-Manzanares, M. Ugarte Pérez, C. Silvestre Pérez-Cerdá // An Pediatr. (Barc.).— 2008. — V. 69. — №. 4. – Р. 358—365.

6. Черенков Д.А. β-Маннаназы различного происхождения: получение, характеристика и перспективы практического применения [Текст] / Д.А. Черенков, О.С. Корнеева, Е.П. Анохина, Е.Г. Новоселова, А.С. Глущенко, А.А. Слепокуров, И.В. Черемушкина // Успехи современной биологии. - 2010. - Т. 130. - № 2. - С. 190-199.