Диагностика возбудителей фитофторозов малины и земляники в почве путем сочетания метода биоприманок и ПЦР «В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ»

С.Е. Головин, д. с.-х. н., ГНУ Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства (Москва),

М. Б. Копина, к. с.-х. н., ФГБУ Всероссийский центр карантина растений.

Корневые гнили малины и земляники, вызываемые возбудителями рода Phytophthora, являются наиболее вредоносными и малоизученными болезнями этих культур. В видовом составе возбудителей фитофторозов малины и земляники насчитывается более 10 видов из рода Phytophthora [1, 4]. Исключительно вредоносной болезнью этих культур является гниль корней, вызываемая карантинным объектом Ph. fragariae Hickm.

Для своевременной и точной идентификации и обнаружения возбудителей необходима эффективная диагностика. Из-за нехватки устойчивых морфологических признаков возникают трудности диагностики представителей рода Phytophthora до конкретного вида. Необходимость разработки и усовершенствования молекулярных методов диагностики и идентификации фитофторозов малины и земляники, обуславливает актуальность и практическую значимость настоящего исследования.

Материалы и методы. В работе использовали 8 штаммов культур Phytophthora sp., 6 из которых возбудители фитофторозов малины и земляники. Биоприманки закладывали по методике С.Е. Головина [2].

Для определения наиболее подходящего метода выделения ДНК из биоприманок проводилось заражение почвы гомогенизированным в воде мицелием Ph. cactorum. Из 7-ми дневной культуры возбудителя, выращенной на чашке Петри, делали высечки диаметром 10 мм. В колбу объемом 250 мл помещали высечки и добавляли стерильной воды до 150 мл, измельчали в гомогенизаторе при 2000 об/мин в течение 5 минут. Навеску почвы массой 36,7 г. помещали в чашку Петри и заливали 15 мл полученного гомогенизата мицелия Ph. cactorum, на поверхность которого помещали листья малины. Инкубировали чашки Петри при 15-18 ºС. На 3-5 день из некротизированных биоприманок вырезали кусочки растительной ткани размером 0,5х1,0 см и проводили выделение ДНК.

Выделение ДНК из растительного материала и чистых культур проводили следующими методами: с использованием наборов «Проба ГС», («ДНК-Технология», Москва); «ДНК-Экстран», «Сорб-ГМО-А», «Сорб-С» («Синтол», Москва); на основе метода выделения CTAB-SDS (http://pcr-rus.narod.ru/protocols.html) в отдельные этапы которого были внесены изменения, в соответствии с инструкцией к набору “Loewe” (Германия), для диагностики Phytoplasma в сосудистой ткани винограда, а также согласно методике описанной J.J. Doyle [3].

Амплификацию и детекцию в реальном времени проводили на амплификаторе iCycler iQ 5 (Bio-Rad, США). Для проведения ПЦР «в реальном времени» были разработаны универсальные праймеры и четыре специфичных зонда. Подбор праймеров и зондов осуществлялся на основе гена Ypt [5].

Результаты и обсуждение

Для определения оптимального метода выделения ДНК из биоприманок искусственно зараженных Ph. сactorum отбирали участки некротизированной ткани. После выделения измеряли концентрацию ДНК на спектрофотометре ND-2000 и ставили ПЦР «в реальном времени». Концентрацию ДНК при всех способах выделения выравнивали и вносили по 100 нг на одну реакцию.

Из таблицы 1 видно, что все способы выделения позволяют получить образцы ДНК с высокой концентрацией. Стоит отметить, что при выделении целевой ДНК возбудителя из листа биоприманки происходит выделение в большом количестве растительной ДНК, которая ингибирует ПЦР.

Таблица 1. - Использование различных методов выделения ДНК из биоприманок при поведении ПЦР «в реальном времени»

№ п/п	Метод выделения ДНК	Концентрация ДНК нг/мкл	260/280	260/230	Сt 100нг/реакцию
1	ChL+СТАВ	428,0	1,44	0,88	NA*
		413,4	1,54	0,96	NA
2	LiCl 8М+ СТАВ	358,1	1,40	0,83	NA
		352,5	1,48	0,90	NA
3	ChL+СТАВ (оптимизированный)	159,6	1,51	0,96	NA
		190,4	1,51	0,97	NA
4	«ДНК-Экстран»	229,6	1,70	0,04	NA
		593,1	1,13	0,77	NA
5	«Проба ГС»	175,2	1,19	0,67	NA
		145,2	1,18	0,89	NA
6	«Сорб-ГМО-А»	33,3	1,78	1,86	33,0
		40,5	1,87	2,26	32,9
7	«Сорб-С»	155,9	1,11	0,28	NA
		140,3	1,14	0,21	NA
8	Doyle J.J., Doyle J.L. (1990)	97,3	1,98	1,64	26,1
		104,4	2,0	1,84	26,0
9	Loewe Phytoplasma	104,9	1,76	1,21	31,5
		93,4	2,59	1,44	32,9

Поэтому при постановке ПЦР «в реальном времени» с образцами ДНК, выделенными методами №1-3, «ДНК-Экстран», «Сорб-С», концентрация которых была наибольшей среди всех способов, флуоресценция по красителю не регистрировалась, что говорит об отсутствии целевой ДНК или её сильном ингибировании. Степень чистоты образцов ДНК выделенных этими методами была очень низкая (соотношение 260/280 варьировало от 1,11 до 1,70;соотношение 260/230 менее 1,0)

Использование набора «Сорб-ГМО-А», выделение ДНК согласно набору “Loewe” (Phytoplasma), по методике описанной J.J. Doyle [3] позволяет получать ДНК возбудителя приемлемой чистоты (соотношение 260/280 варьировало от 1,76 до 2,59;соотношение 260/230 варьировало от 1,21 до 2,26). Несмотря на то, что концентрация выделенной ДНК значительно меньше по сравнению с выше описанными методами, при постановке ПЦР «в реальном времени» были получены положительные результаты.

Сравнительный анализ 9 способов выделения ДНК из искусственно зараженной биоприманки возбудителем Ph. cactorum показал, что наиболее подходящим методом пробоподготовки является выделение ДНК, согласно методике J.J. Doyle [3].

Для разработки метода мультиплексной ПЦР с целью одновременного выявления и дифференциации фитофторозов малины и земляники были проанализированы нуклеотидные последовательности гена Ypt этих возбудителей. На основании выровненных последовательностей, нами были подобраны праймеры универсальные для рода Phytophthora sp.- левый-caa gac yat caa gct sca, правый-gtt gtt gaa cga hga ctc ytgg и меченные флуоресцентными красителями зонды, Ph. cactorum - Ph.cac - R6G-acg tgg cgt gtt tcc tat-BHQ2, Ph. fragariae - Ph.FR- FAM-cat ttc gcc ggc taa gcg tg-RTQ1, Ph. nicotianae - Ph.nic - Cy5-ccg atg tac caa atc acg tgt gtg tc-BHQ2, Ph. citricola - Ph.cit - ROX-ggt tgt gcc aat tca ctt gtg ct-BHQ2.

После подбора зондов проверяли их специфичность. Было установлено, что флуоресценция по 4 красителям, специфичных для Ph. fragariae, Ph. cactorum, Ph. nicotianae и Ph. citricola регистрировалась только при наличии ДНК чистых культур этих возбудителей. Подобранные зонды не давали ложноположительных реакций с другими видами Phytophthora sp.

Далее проводили эксперименты по использованию всех четырех зондов в одной пробирке. Было показано, что 4 видоспецифичных зонда способны выявлять целевой вид возбудителя фитофтороза, даже если он находится в смеси с другими видами. Результаты экспериментов представлены в таблице 2.

Таблица 2. - Значения Ct при проведении ПЦР «в реальном времени» с различными видами Phytophthora sp. в одной пробирке

Культура	название зонда
	Ph.FR	Ph.cac	Ph.cit	Ph.nic
Ph.fragariae	24,7	N/A	N/A	N/A
Ph.cactorum	N/A	24,6	N/A	N/A
Ph.citricola	N/A	N/A	27,7	N/A
Ph.nicotianae	N/A	N/A	N/A	28,0
Ph.fragariae + Ph.nicotianae	26,3	N/A	N/A	30,0
Ph.fragariae + Ph.cactorum	25,9	25,7	N/A	N/A
Ph.fragariae + Ph.citricola	29,7	N/A	30,5	N/A
Ph.cactorum + Ph.nicotianae	N/A	26,2	N/A	29,8
Ph.cactorum +P.citricola	N/A	28,0	31,0	N/A
P.citricola+ Ph.nicotianae	N/A	N/A	28,9	28,9
Ph.fragariae + Ph.cactorum + Ph.nicotianae	26,7	26,7	N/A	30,4
Ph.fragariae + Ph.cactorum + Ph.citricola	29,1	28,4	29,4	N/A
Ph.cactorum + Ph.nicotianae + Ph.citricola	N/A	28,5	29,2	30,0
Ph.fragariae + Ph.cactorum + Ph.nicotianae + Ph.citricola	28,7	28,8	28,9	28,2

Выводы

Для диагностики возбудителей фитофторозных корневых гнилей малины и земляники методом ПЦР «в реальном времени» выделение ДНК из биоприманок необходимо проводить по методике описанной J.J. Doyle [3].

Подобранные праймеры и меченные различными флуоресцентными красителями зонды позволяли проводить ПЦР «в реальном времени» для выявления и идентификации четырех видов оомицетов Ph. nicotianae, Ph. citricola, Ph. fragariae и Ph. cactorum в одной пробирке.

Литература

1. Барбатунова Г.А. Изучение фитофтороза земляники и изыскание мер борьбы с ними в центральных районах Нечерноземной полосы. Автореф. диссер. канд. биол. наук. Москва. – 1986. - 24 с.

2. Головин С. Е. Методические указания по диагностике и учету болезней корней и стеблей земляники и малины, передающихся через почву. M.:ВСТИСП.- 2001.-42 с.

3. Doyle J.J., Doyle J.L. Isolation of plant DNA from fresh tissue//Focus.Life technolog. inc.- 1990.V. 12.P. 13-15.

4. Duncan J. M., Kennedy D. M., Seemuller E. Identities and pathogenicities of Phytophthora sp. causing root rot of red raspberry//Plant Pathology-1987. - V.36.№7.P. 276-289

5. Schena L., Duncan J.M., Cooke D.E.L. Development and application of a PCR-based molecular tool box for the identification of Phytophthora species damaging forests and natural ecosystem//Plant Path.-2008 -V.57.№7.P. 64-75