Биологические науки/6.
Микробиология
Мокрушина О.С., к.б.н. Андреева И.С., д.б.н. Мазуркова
Н.А.
ФБУН государственный научный центр
вирусологии и биотехнологии «Вектор», п. Кольцово Новосибирской обл., Россия
ШТАММ BACILLUS THURINGIENSIS SSP. FINITIMUS АК-3, НЕЙТРАЛИЗУЮЩИЙ РАЗМНОЖЕНИЕ ВИРУСОВ ГРИППА НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ
КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК
В последние 10 лет эпидемиологически значимыми для
человека являлись вирусы гриппа «А» с поверхностными антигенами А(H1N1),
A(H2N2), А(H3N2), способные к быстрому генетическому изменению. Это их свойство
создает большие проблемы при лечении инфицированных вирусом гриппа как человека, так и животных и птиц. Отмечается высокая
заболеваемость населения (до 40 %) с почти одинаковым поражением всех
возрастных групп. В связи с этим поиск новых средств противовирусной защиты и
создание препаратов, подавляющих вирусную активность, имеет особую
актуальность. Известно, что бактерии рода Bacillus
обладают избирательным антагонистическим действием в отношении бактерий и
грибов, вируса полиомиелита I типа, вирусов ECHO 3 и ECHO 6, вирусов Коксаки [1-3].
Антибиотическое действие штаммов Bacillus thuringiensis (Bt) более всего проявляется
относительно бактерий, дрожжей и грибов [2]. Ранее авторами была показана высокая
активность штамма подвида Bt ssp. galleriae относительно
вирусов гриппа [4].
В настоящей работе приводятся данные по исследованию
способности метаболитов штамма Bt ssp. finitimus АК-3 к подавлению
размножения вирусов гриппа человека А/Aichi/2/68 (A/H3N2) и вируса гриппа птиц
A/chicken/Kurgan/05/2005 (А/H5N1) на чувствительной к ним перевиваемой культуре
клеток MDCK.
Материалы и методы
В работе использовали штамм Bt ssp. finitimus АК-3 (Н2), депонированный в «Коллекции бактерий бактериофагов и
грибов ФБУН ГНЦ ВБ “Вектор”» под коллекционным номером В-1274. Морфологию клеток штамма исследовали методом
фазово-контрастной микроскопии с помощью микроскопа Axioskop 40 (Carl Zeiss,
Германия), изучение физиологических и биохимических свойств, проведение
косвенных тестов на патогенность выполняли стандартными методами [5, 6]. Хранение штамма осуществляли
в 15% растворе глицерина при низкотемпературном замораживании и в
лиофильно-высушенном состоянии.
Приготовление
препарата для тестирования на противовирусную активность. Для приготовления препаратов использовали бульонную культуру штамма Вt ssp.
finitimus АК-3, находящуюся в
вегетативной стадии развития. Отсутствие процесса споруляции и формирования параспоральных включений
контролировали при микроскопировании
культуры методом фазового контраста. Культуральную
жидкость (КЖ) штамма Bt,
наработанную в течение 20 ч на термостатированной качалке при температуре 30°С,
освобождали от клеток центрифугированием при 6000 об./мин в течение 30 мин, стерилизовали
ультрафильтрацией через фильтры Whatman и тестировали на токсичность и противовирусную
активность. До использования фильтраты КЖ хранили при температуре минус
18-20°С. Для
определения токсических доз готовили разведения препаратов в соотношении 1:2, 1:5, 1:10, 1:20 с
использованием ростовой среды культуры клеток.
Определение
токсичности и противовирусной активности образцов препаратов проводили с использованием штаммов вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (А/H5N1) и
вируса гриппа человека А/Aichi/2/68
(A/H3N2) из
«Коллекции микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ “Вектор”» и чувствительной к ним перевиваемой культуры клеток MDCK,
полученной из «Коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ “Вектор”» с применением методики,
описанной ранее [4].
Результаты и обсуждение
Фенотипические
признаки штамма.
Штаммы серотипа Bt ssp. finitimus относятся к немногим подвидам Bt,
формирующим параспоральные кристаллы, остающиеся после разрушения экзоспориума связанными
со спорой в характерные парные образования (“spore crystal association” - SCA).
Штамм Bt ssp. finitimus АК-3 имел типичную для этого подвида
морфологию и биохимические признаки. На агаризованной среде Nutrient Broth (NBA) штамм формировал округлые, белесые,
плоские, непрозрачные колонии. Клетки штамма палочковидные, размером
1,2-1,5×3-5 мкм, были расположены по 2 или в цепочках (рис 1, А). Округлые
параспоральные включения после лизиса материнской клетки оставались
соединенными со спорой (рис.1, Б).
|
|
|
|
А. Вегетативные
клетки |
Б. Споры и кристаллы |
Рис.1.
Морфология вегетативных клеток, спор и кристаллов штамма Вt ssp. finitimus АК-3; фазово-контрастная микроскопия,
×2500.
Штамм восстанавливал нитраты, был положителен
в реакциях MR, FP, в реакции на каталазу, оксидазу, уреазу, амилазу, липазную,
лецитиназную и гемолитическую активность, гидролизовал желатин; был отрицателен
в реакциях на плазмокоагулазную и фибринолитическую активность, в реакции на
фосфатазу; не образовывал индол, сероводород, аммиак, не утилизировал цитрат; гидролизовал
глюкозу, мальтозу, но не арабинозу, ксилозу, лактозу, сахарозу. К косвенным
признакам патогенности штамма можно отнести наличие гемолитической, липазной,
лецитиназной и желатиназной активностей, способствующих реализации его
антагонистических свойств.
Токсичность и
противовирусная активность. Отсутствие токсичности или слабое ее проявление при высокой
активности препарата относительно вирусного агента является важным сочетанием рекомендуемых
свойств противовирусных средств. В результате выполненной работы выяснено, что исследуемые препараты были слабо токсичны относительно
клеточной культуры MDCK до разведения 1:2. Разведения образцов препаратов 1:5 и далее были для
клеток MDCK нетоксичны (табл.1). Для оценки противовирусной активности
образцов препаратов в дальнейших опытах использовали разведение 1:2 (табл. 2)
Таблица 1. Определение
токсичности препаратов на основе КЖ штамма Bt ssp. finitimus АК-3
по отношению к
культуре клеток MDCK
|
Штамм |
Образцы препаратов/наличие токсичности |
Контроль клеток |
||||||||||
|
Без разведения |
Разведение образцов |
|||||||||||
|
1:2 |
1:5 |
1:10 |
1:20 |
|||||||||
|
В-1274 АК-3 |
+ |
+ |
± |
± |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
Обозначения: + токсичность есть; ± слабая токсичность; - отсутствие токсичности.
Таблица 2. Определение противовирусной активности
препаратов на основе КЖ штамма Bt ssp. finitimus АК-3
|
Образец |
Титр вируса в lg ТЦД50/мл через 48
ч |
|||||
|
A/Aichi/2/68 (H3N2) |
A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) |
|||||
|
Опыт 1 |
Опыт 2 |
Опыт 3 |
Опыт 1 |
Опыт 2 |
Опыт 3 |
|
|
В-1274 АК-3 |
2,5 |
3,2 |
2,0 |
1,3 |
1,7 |
2,0 |
|
Контроль вируса |
3,5 |
4,0 |
3,0 |
6,5 |
7,0 |
7,2 |
Как видно из таблицы 2, штамм
В-1274 активно подавляет вирус гриппа птиц A/H5N1: титр вируса в опытных вариантах по сравнению с
контролем значительно снижен, составляет в среднем 1,66 lg ТЦД50/мл.
Относительно вируса гриппа человека A/H3N2 наблюдается
слабое противовирусное действие, изменение титра вируса под воздействием
препарата незначительно. Следует отметить, что препараты, хранящиеся в
замороженном состоянии при минус 18-20°С в течение 3-х месяцев, сохранили
уровень активности относительно испытуемых вирусов гриппа, что свидетельствует
о стабильности препаратов в течение срока наблюдения. Полученные данные позволяют
считать штамм Bacillus thuringiensis ssp. finitimus АК-3 перспективным в качестве основы разрабатываемых препаратов
для лечения и профилактики заболеваний, вызванных чувствительными к ним вирусами
гриппа.
Литература:
1. Юдина Т.Г., Бурцева Л.И. Действие дельта-эндотоксинов четырех подвидов B. thuringiensis на различных прокариот // Микробиология. 1997. Т. 66, № 1. С. 25-31.
2.
Патогены насекомых:
структурные и функциональные аспекты / Под ред. Глупова В. В. М.: Круглый год,
2001. 716 c.
3.
Патент РФ № 2405821, публ.
10.12.2010 МПК С12№1/20. Гринько О.М., Михайлова Н.А., Пашков Е.П., Буданова
Е.В. Штамм бактерий Bacillus pumilus «пашков»
- продуцент биологически активных веществ, обладающих антагонистической
активностью в отношении условно-патогенных, патогенных бактерий, дрожжевых
грибов и вирусов.
4.
Мокрушина О.С., Андреева И.С., Мазуркова Н.А., Бурцева Л.И., Закабунин А.И.
Антагонистические свойства штамма Bacillus
thuringiensis ssp. galleria АК-4, выделенного из осадочных пород
озера Байкал / Международный научно-исследовательский журнал (Россия,
Екатеринбург, 2013г.), 8(15) 2013. С.74-77.
5. Методы общей бактериологии /Под ред. Ф. Герхарда и др. М.: Мир, 1983. Т. 1. 536 с.; 1984. Т. 3. 264 с.
6. "Bergey's Manual
of Systematic Bacteriology". 8th ed. / Ed. John G. Holt. –
Baltimore-London, Williams and Wilkins, 1986. V.1-2. 1105 p.