К.б.н. Лахтин М.В., д.б.н. Лахтин В.М.,

д.м.н. проф. Афанасьев С.С., д.м.н. проф. Афанасьев М.С.

Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского, Россия

ВЫЯВЛЕНИЕ ФЛЮОРОФОРНЫХ КОМПОНЕНТОВ КУЛЬТУР ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ НА ГИДРОФОБНОЙ ПОРИСТОЙ ПОВЕРХНОСТИ

Резюме

Предложен твердофазный высокочувствительный экспресс-анализ собственной флюоресценции культуральных надосадков, их высокомолекулярных концентратов и ультрафилдьтратов, белков, подтвержденный анализом с использованием флюоресцентного красителя.

Ключевые слова: лактобациллы, бифидобактерии, флюорофоры, культуры, твердофазный анализ.

Resume

Lakhtin M.V., Lakhtin V.M., Afanasiev S.S., Afanasiev M.S. G.N. Gabrichevsky Research Institute for Epidemiology & Microbiology, Russia. Detection of fluorophores of Gram positive bacterial cultures on the hydrophobic pore surface.

Highly sensitive express solid-phase assay of bacterial cultural fluorophores was proposed. Results were confirmed using additional fluorescent dye staining.

Key words: lactobacilli, bifidobacteria, fluorophores, cultures, solid-phase assay.

Введение. Культуральные жидкости (КЖ) – источники флюорогенных биологически активных низкомолекулярных веществ (аминокислот, [глико]пептидов, других; способных к регистрируемому возбуждению флюоресценции, характеризующей продукты в КЖ и облегчающей мониторинг их образования и расходования) и высокомолекулярных веществ (белков, белок-содержащих, других; с в различной степени маскированными флюорофорами и/или взаимодействующих с флюоресцентными красителями). Такие флюорофоры-содержащие молекулы (ФСМ) и Ф-связывающие комплексы (ФСК) участвуют в сигнальных, синергистических/согласованных (в том числе каскадных) процессах нано/микро- и макросистемного био-узнавания/(селективного распознавания), выполняют жизненно важные макрофункции в окружении и на поверхности бактерий (смотри также другую нашу статью в настоящем сборнике). Цель - с помощью твердофазного анализа (ТФА) исследовать типы ФСМ и ФСК КЖ грамположительных бактерий на примере пробиотических штаммов бифидобактерий и лактобацилл человека, мультиштаммового консорциума.

Материалы и методы. Препаратами служили разбавления в 10 мМ фосфатно-солевом буфере 7.4 (ФСБ) обезжиренных и деэмульсифицированных КЖ (супернатантов), высокомолекулярных концентратов (более 27 кД; получены в центрифужных стаканах Centricon Plus-20) и ультрафильтратов (после Centricon Plus-20) КЖ лактобацилл Lactobacillus helveticus (штаммы NK1 и 100_аш), L. casei K₃III₂₄, пробиотика Ацилакт (NK1+100_аш +K₃III₂₄), бифидобактерий Bifidobacterium longum MC-42 - все выращены на среде КД-5с (18-24 ч при 37^оС). Белок определяли в области поглощения пептидных связей по Waddel, 1956: [мкг/мл]= (D₂₁₅ - D₂₂₅)x144, где 144- коэффициент, рассчитанный для БСА (бычьего сывороточного альбумина – негликозилированного, не содержащего липидов, с высокой гидрофобностью). Для повышения сорбции материала в дотах и увеличения числа экспонированных флюорофоров блоты обрабатывали 2-5 мМ дитиотреитолом в ФСБ (80^оС, 6-7 мин). Для исключения влияния на ТФА гидролаз образцы КЖ кипятили 30 мин. КЖ содержали до 1 мкг/мкл гидрофобного белка. Образцы (по 3 мкл сериальных разбавлений КЖ, исходно сконцентрированных в 60-100 раз КЖ или БСА [исходно 2 мг/мл в ФСБ] в 10, 100, 1000, 10000 и 100000 раз; стоковые разведения готовили заранее и хранили в эппендорфах при -35^оС) наносили рядами дотов на гидрофобную PVDF-мембрану Immobillon-P (Millipore). Флюоресценцию компонентов (собственную или после обработки красителем SYPRO Ruby protein blot stain [далее - SYPRO] - сравнимым с коллоидным золотом по чувствительности; на основе рутения [Ru]; не реагирует с нуклеиновыми кислотами, имеет пики возбуждения 280 и 450 нм и пик испускания флюоресценции около 618 нм) определяли на сухих блотах в режиме живого изображения в системе BioChemi System (UVP; возбуждение 254 нм [возбуждение Phe, Tyr и Trp, их модификаций, SYPRO) или 365 нм (возбуждение SYPRO) и регистрации серий картин свечения с использованием светофильтра Coomassie (возбуждение 254 нм позволяет оценивать также выраженность белка [его вклад в флюоресценцию] в разведениях супернатанта или его концентрата до обработки блота посредством SYPRO) или светофильтра Ethidium Bromide (570-640 нм: оранжевый свет); интервал ступеней времени накопления флюоресценции 270 - 60000 миллисекунд (получение взаимодополняющей информации, в зависимости от оптимизации выполнения типа задачи). В ряде случаев для повышения чувствительности измерения проводили в условиях термостатирования блота при 50-55^оС. Для количественного сравнения флюоресценции области дотов сканировали. В анализе использовали пакет программ LabWorks.

Результаты и их обсуждение.

1. ФСМ с собственной флюоресценцией. ТФА выявил наличие регистрируемой нестабильной флюоресценции (появляющейся при разбавлениях как в случае БСА или способной нарушать дозовую зависимость в разбавлениях как в случае концентратов супернатантов КЖ; не нарушалась дозовая зависимость в случае супернатантов КЖ) в составе сорбированных препаратов (высокомолекулярных концентратов, исходных супернатантов КЖ; БСА – выявлялся в разведении в 100000 раз [20 пг/минимальный дот, рис. 1]), варьирующей в зависимости от условий ее возбуждения и накопления, разбавлений, обработок блотов. Выявлены два типа ФСМ в КЖ: а) мажорный - экзополисахарид/(экзополимерные соединения)-подобный с низкой способностью к сорбции, с изоэлектрической точкой в околонейтральной области; б) минорный – с хорошей сорбцией в зоне нанесения, при разведениях супернатантов в 10-100 раз.

Выраженность ФСМ у лактобацилл была выше, чем у бифидобактерий, а общее содержание ФСМ (возбуждение 254 нм, фильтр Ethidium Bromide, накопление сигнала 10000-40000 мсек) снижалось у супернатантов КЖ бактерий: 100аш>K3III24>NK1>MC42>Ацилакт. При возбуждении 365 нм воспроизводимость результатов (сходимость измерений в парах разных партий [бэтчей] образцов КЖ одного и того же штамма/консорциума раздельно выращенных бактерий одного и того же штамма) повышалась на фоне снижения интенсивности флюоресценции (рис. 1); при этом ранжирование ФСМ КЖ лактобацилл становилось более контрастным (сильнее различалось) в группах сравнения: 100_аш>K₃III₂₄ (группа с повышенными уровнями ФСМ); МС-42>Ацилакт (группа с относительно сниженными уровнями ФСМ).

2. ФСК КЖ. Использование SYPRO во всех случаях улучшало, полностью или частично восстанавливало дозовую зависимость проявления флюоресценции в рядах разбавлений БСА, супернатантов и их концентратов. Поскольку при разведениях супернатантов КЖ в 100 раз собственная флюоресценция дотов была слабой или отсутствовала, дальнейшее исследование дотов с высокими разбавлениями препаратов проводили с использованием SYPRO, повышающим чувствительность ТФА и позволяющего регистрировать ФСК в таких разведениях без вклада собственной флюоресценции. В случае концентратов супернатантов КЖ нестабильность (например, у ФСМ в ряду разбавлений концентрата КЖ NK1) и на порядок сниженная чувствительность устранялись после термообработки блота в присутствии дитиотреитола (рис. 2). В результате достигалась стабильная дозовая зависимость денатурированных дитиотреитолом ФСМ в рядах разбавлений, в том числе для разбавлений в 1000 раз было возможно видимое ранжирование относительного содержания ФСМ [возбуждение 254 нм, фильтр Coomassie, 270-750 мсек]: 100_аш>NK1>K₃III₂₄>Ацилакт).

Сопоставление ранжированных последовательностей указывают на выраженные различия между высокомолекулярными и низкомолекулярными флюорофорными компонентами концентратов и супернатантов. Полученные данные подтверждают, что флюорофоры в ФСМ маскированы (ФСМ в составе комплексов и надмолекулярных ансамблей) в КЖ и концентратах; по мере разбавлений происходят демаскирование и рефолдинг молекул, приближение к фолдингу нативного состояния молекул и, как результат, появление/проявление флюоресцентных свойств ФСМ. Таким высоким разбавлениям соответствуют оптимальные - рабочие разведения, обеспечивающие максимальную флюоресценцию и биологическую активность.

Заключение. Предложенный оптимизированный ТФА (без или с использованием дитиотреитола) для мониторинга и характеристики собственной флюоресценции нативных ФСМ КЖ и их фракций является высокочувствительным в детекции белковых и небелковых флюорофоров (маскированных и демаскированных в составе ФСМ и их комплексов), высоконадежным инструментом экспресс-микроанализа (время ТФА с использованием SYPRO – менее 3 ч) штаммовых различий центрифугатов и фильтратов КЖ бактерий, отслеживания процессов биосинтеза и гидролиза сигналов в КЖ, выбора штаммов для конструирования консорциумов. Он перспективен в исследовании культур любых грамположительных бактерий, в том числе миникультур, а также для микропанельных и биочиповых вариантов ТФА. Использование модификации ФСМ посредством SYPRO для подтверждения результатов собственной флюоресценции ФСМ не обязательно в условиях применения установленной стандартизированной процедуры регистрации собственной флюоресценции известных препаратов. Определение ФСМ и ФСК посредством ТФА является важной составляющей общего лабораторного анализа КЖ бактерий (сделан нами), включающего оценки общего и частично гидролизованного белка, лектинов, биосурфактантов и других экзополимерных соединений, степень эмульсифицирования, степени гидролиза компонентов (в том числе присутствия ароматических аминокислот), потенциального присутствия гликированных аминокислот/пептидов, сравнительной слабой выраженности пигментирования супернатантов, наличия эффективных ферментативных гидролитических и оксидоредуктазных систем (в том числе распределенных в консорциуме штамм-зависимым образом).

Рис. 1. Флюоресценция блота размером 6 х 7 клеток/дотов: слева - собственная флюоресценция препаратов, справа - после обработки SYPRO. Возбуждение 365 нм, фильтр Ethidium Bromide, экспозиция 30000 мсек. Слева-направо – разбавления препаратов (по 3 клетки на препарат; БСА: 1000, 10000, 100000 раз; супернатанты КЖ: 10, 100, 1000). Сверху-вниз – препараты. 1-й ряд: БСА (3 клетки), БСА-повтор (следующие 3 клетки); 2-й ряд: Ацилакт, 100_аш; 3-й ряд: NK1, K₃III₂₄; 4-й ряд: МС-42, K₃III₂₄; 5-й ряд: Ацилакт, МС-42; 6-й ряд: NK1, 100_аш; 7-й ряд: БСА, МС-42.

Рис. 2. Флюоресценция SYPRO-блотов. Левый блот: без (слева) или после обработки дитиотреитолом (справа: видны вертикальные границы). Возбуждение 254 нм, Coomassie, 540 мсек, 50^оС. Слева-направо – разбавления препаратов (по 4 клетки на препарат: 10, 100, 1000, 10000). Сверху-вниз – препараты. 1-й ряд: БСА (4 клетки), БСА-повтор (следующие 4 клетки); 2-й ряд: концентраты 100_аш (4 клетки) и Ацилакта (4 клетки); 3-й ряд: концентрат NK1 (4 клетки, повтор – следующие 4 клетки); 4-й ряд: концентрат K₃III₂₄ (4 клетки), ультрафильтрат NK1 (после Centricon Plus-20) с более выраженными цветными примесями (4 клетки: разбавления 10, 10, 100, 1000); 5-й ряд: концентрат Ацилакта (4 клетки), ультрафильтрат Ацилакта с менее выраженными цветными примесями (4 клетки: разбавления 10, 10, 100, 1000). Правый Блот: как левый, но в другой редакции (флюоресценция БСА быстро «обесцвечивается» в условиях регистрации при 50^оС).