К. б. н. Гойкалова О.Ю.¹, д.б.н. Корнеева О.С.¹, д.х.н. Кузнецов В.А.²

¹Воронежский государственный университет инженерных технологий, Россия

²Воронежский государственный университет, Россия

ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССА ИММОБИЛИЗАЦИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК С ЦЕЛЬЮ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОМАЛЬТУЛОЗЫ

Использование процесса иммобилизации клеток микроорганизмов с целью получения биологически активных веществ - продуктов ферментативных реакций, является актуальным в настоящее время.

На кафедре биохимии и биотехнологии Воронежского государственного университета инженерных технологий разработана биотехнология натурального сахарозаменителя изомальтулозы с применением высокоактивной изомальтулозосинтазы бактериального происхождения [1, 2]. Изомальтулоза отличается низкой калорийностью (2 ккал/г), низким гликемическим индексом (2 ед.), не вызывает кариеса зубов, обладает пребиотическим действием. Однако в настоящее время отсутствует отечественная технология получения данного сахарозаменителя с применением способа иммобилизации бактериальных клеток, что позволит увеличить кратность использования иммобилизованного фермента, удешевить себестоимость изомальтулозы и увеличить стабильность фермента.

Целью настоящей работы являлись экспериментальные исследования по оптимизации концентрации иммобилизованного фермента изомальтулозосинтазы с целью получения изомальтулозы, обладающей пребиотическим действием. Иммобилизации подвергали бактерии Erwinia rhapontici. Культивирование бактерий проводили на среде следующего состава (г/дм³): пептон – 10, дрожжевой экстракт – 5, NaCl – 10, сахароза – 40. Культуру выращивали в периодических условиях в течение 3 сут при 28-30 °С, рН_исх 7,0±0,1. Клетки осаждали центрифугированием и суспендировали в растворе фосфатного буфера с рН 6,0. В качестве носителя в процессе иммобилизации бактериальных клеток использовали предельные циклические N-виниламиды, в ряду которых наибольший интерес представляют N-винилпирролидон. Для проведения иммобилизации клеток были синтезированы полимеры N-винилпирролидона с различной молекулярной массой (500- 3000 кДа). Иммобилизации подвергали живые бактериальные клетки. Контроль связывания носителя с бактериальной культурой осуществляли с использованием метода ИК-спектроскопии. Реакцию изомеризации сахарозы в изомальтулозу проводили в течение 3,0-3,5 ч при температуре 30 °С [3]. Продукты ферментативной реакции контролировали по методу Сомоджи-Нельсона, глюкозооксидазным методом, а также с использованием методов тонкослойной хроматографии. В ходе проведения исследования было установлено оптимальное значение молекулярной массы N-винилпирролидона, а также дозировка фермента, используемого для процесса иммобилизации.

Проведенные исследования показали, что оптимальным значением N-винилпирролидона для процесса иммобилизации бактериальных клеток является 500 кДа, при котором выход изомальтулозы составляет 93-95 % (рис. 1).

Рис. 1. Влияние молекулярной массы N-винилпирролидона на процесс биотрансформации сахарозы, СТ – степень трансформации

Уменьшение или увеличение молекулярного веса полимера приводило к снижению степени трансформации сахарозы. Установлено, что при использовании полимера с молекулярной массой 1000 кДа наблюдалось снижение концентрации изомальтулозы к 3 ч процесса до 60-70 %.

Для определения оптимальной концентрации иммобилизованного фермента трансформацию сахарозы проводили с различной дозировкой изомальтулозосинтазы (1-15 Е/мг сахарозы). Установлено, что оптимальным значением дозировки фермента является 5 Е/мг.

Таким образом, максимальный выход изомальтулозы (92-95 %), полученной с применением метода иммобилизации бактериальных клеток, достигается при использовании N-винилпирролидона с молекулярной массой 500 кДа при дозировке фермента 5 Е/мг субстрата.

Литература:

1. Корнеева, О. С. Применение изомальтулозосинтазы Erwinia rhapontici с целью трансформации сахарозы в изомальтулозу [Текст] / О. С. Корнеева, О. Ю. Божко // Вестник ОГУ. – Оренбург, 2009. - № 4. С. 130-134.

2. Корнеева, О. С. Биотехнология изомальтулозы - природного заменителя сахара с пребиотическими свойствами [Текст] // О. С. Корнеева, О. Ю. Божко, Г. П. Шуваева / Биотехнология. - 2008. - № 2. - С. 46-50.

3. Биокаталитическая технология натурального заменителя сахара // Материалы XIV Всероссийской заочной научно-технической конференции «Современные промышленные технологии». - Нижний Новгород: ННИМЦ «Диалог», 2009. – С. 15.