Медицина/морфология

К.б.н. Д.Е. Григоренко

ФГБУ НИИ морфологии человека РАМН, Москва

Особенности реакции лимфоидной (иммунной) ткани селезенки мышей после космического полета и авиационного перелета

В условиях космического полета на организм человека воздействуют различные факторы внешней среды, наиболее значимыми из которых является невесомость и гравитация [1,2]. Известно, что влияние невесомости в условиях космического полета приводит к перераспределению крови и изменению давления жидких сред в организме, к снятию весовой нагрузки на опорные структуры и мышечную систему и изменению нейроэндокринной системы, тогда как гравитационные нагрузки в некоторой степени нивелируют эти изменения [3, 4, 5]. Применение сочетанного воздействия гипокинезии и гипергравитации также оказывает профилактическое действие на состояние некоторых органов иммунной системы, в частности, паховых лимфатических узлов у обезьян [6,7,8]. Для изучения влияния отмеченных факторов на организм млекопитающих на космическом биоспутнике проведен эксперимент «БИОН-М1», целью которого было исследование физиологического состояния мышей и функционального состояния некоторых органов и тканей у мышей [9]. Несмотря на многочисленные биохимические и физиологические исследования, менее всего изучены морфологические изменения органов иммуногенеза у животного организма в условиях космического полета. Вместе с тем известно, что именно состояние иммунной системы характеризует и обеспечивает стабильное функционирование организма при воздействии различных внешних факторов [10]. Исходя из этого, целью нашего исследования являлось изучение особенностей реакции иммунной (лимфоидной) ткани селезенки у мышей после авиационного перелета и после 30-суточного космического полета.

В эксперименте приняли участие мыши-самцы C57 BL/6 в возрасте 19-20 недель. Изучены 3 группы животных. Виварный контроль (6 особей) – интактные животные находились в обычных условиях содержания. Базальный контроль (9 особей) - мыши осуществляли авиаперелет на Байконур и обратно и содержались в боксах аналогичных в космическом полете [9]. Полетная группа мышей (5 особей) – находилась на борту биоспутника "БИОН-М1" в условиях невесомости в течение 30 сут., где животных содержали в блоках "БИОС-МЛЖ" [9]. Животные виварной группы получали стандартный гранулированный комбикорм и воду в свободном доступе. Полетные животные и мыши базального контроля получали пастообразный корм, изготовленный из стандартного комбикорма, воды и казеина (в качестве загустителя), содержание воды в котором составляло 76-78% [9]. После окончания экспериментов животные всех групп были забиты методом цервикальной дислокации. Селезенки мышей фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, заливали в парафин. Гистологические срезы, толщиной 4-5 мкм, окрашивали азур2-эозином, гематоксилином-эозином и по ван Гизон. В селезенке исследовали цитоархитектонику центров размножения лимфоидных узелков, являющихся зоной созревания В-лимфоцитов и характеризующих состояние гуморального иммунитета, а также клеточный состав периартериальных лимфоидных муфт (ПАЛМ) - морфологической зоны созревания и накопления Т-лимфоцитов, определяющих состояние клеточного иммунитета в организме животных [10,11]. Изучен качественный и количественный клеточный состав лимфоидных структур селезенки на единице площади гистологического среза (в 880мкм²). Подсчет всех клеток в лимфоидных зонах селезенки проводили под микроскопом Leica при увеличении объектива – х100, под масляной иммерсией. Использовали 25-узловую морфометрическую сетку с шагом 10 мкм, вмонтированную в окуляр (10х) микроскопа. Анализ абсолютного и относительного (в %) числа клеток в структурных зонах органа проводили на единице площади гистологического среза (880 мкм²). Статистическая обработка результатов проведена по программе «Statistika 6.0» и Excel. Значимыми считали различия при р≤0,05.

У интактных мышей (виварный контроль) в селезенке лимфоидные образования представлены, в основном, лимфоидными узелками без центра размножения, лимфоидные узелки с центрами размножения - немногочисленны. Центры размножения в лимфоидных узелках небольшие, слабо выражены. Плотность распределения клеток в центрах размножения лимфоидных узелков составляет 45,07±4,18 клетки на единице площади гистологического среза. Основную долю всех клеток в центрах размножения составляют средние лимфоциты (25,27±1,93%). Малодифференцированные клетки представлены бластами и большими лимфоцитами, на долю которых приходится 12,98% (2,82%-бласты и 10,16%-большие лимфоциты, рис.1). Выявлены клетки с картинами митозов (0,93±032%), зрелые (антителпродуцирующие) плазматические клетки (2,04±0,42%) и незрелые плазматические клетки (плазмобласты -0,97±0,43%). Малых лимфоцитов в 1,8 раз меньше, чем средних лимфоцитов. В центрах размножения лимфоидных узелков выявлена значительная доля деструктивно измененных клеток (18,75%). Содержание макрофагальных клеток в 3,7 раза меньше, чем деструктивных клеток.

В селезенке мышей интактной группы периартериальные лимфоидные муфты (ПАЛМ) широкие, четко дифференцируются. Плотность распределения клеток в них составляет 56,73±3,08 клетки на стандартной площади среза. ПАЛМ на 61,0%состоят из малых и средних лимфоцитов (46,37±2,77% и 14,63±1,61%, соответственно). Выявлены клетки в состоянии деструкции (13,67%, рис.2). В ПАЛМ из общего числа малодифференцированных клеток бласты составляют 0,11%, большие лимфоциты -2,71% (рис.1). Плазматические клетки

представлены незрелыми плазмобластами (0,58%) и зрелыми (антителпродуцирующими) плазмоцитами (1,68%). На долю макрофагов приходится всего 2,90%. Клетки с картинами митозов отсутствуют.

Базальный контроль (перелет мышей на Байконур и обратно) можно рассматривать как стрессовую ситуацию на организм животных без воздействия космических сил (гипергравитации и невесомости). В этих условиях в селезенке мышей отмечаются крупные лимфоидные узелки с более широкими центрами размножения, чем в виварном контроле. В базальном контроле в центрах размножения лимфоидных узелков плотность распределения лимфоидных клеток больше, чем в виварном контроле на 20,4 клетки на единице площади среза. Основную долю клеток составляют средние лимфоциты (33,12%) и стромальные ретикулярные клетки (20,76%). Значительная часть клеток приходится на малодифференцированные клетки (17,71%), среди которых содержание бластов (4,14%) в 1,5 раза больше, чем в виварной группе животных (рис.1). Содержание больших лимфоцитов практически одинаково в обеих группах (в виварном контроле - 10,61% и в базальном контроле -13,57 %, различия не достоверны). В базальном контроле в поле зрения на гистологическом срезе в центрах размножения узелков встречается 3-4 клетки в состоянии митоза, которых в 1, 8 раза больше, чем в виварном контроле (рис.1). В центрах размножения лимфоидных узелков среди плазматических клеток вдвое преобладают зрелые (антителпродуцирующие) клетки – 0,60% плазмобластов и 1,31%- плазмоцитов, общее содержание которых в 1,5 раза больше, чем в виварной группе. Клетки в состоянии деструкции в базальном контроле встречаются в 1,6 раза реже, чем в виварном контроле (11,83% и 18,75%, соответственно, рис.2) и в 1, 4 раза меньше выявлено макрофагов.

В периартериальных лимфоидных муфтах (ПАЛМ) селезенки мышей в базальном контроле плотность распределения клеток на стандартной площади среза достоверно не отличается от показателей в виварной группе (11,64 клетки и 13,67 клетки, соответственно). Также выявлено практически равное содержание лимфоцитов (64,12%- в базальном контроле и 61,0% - в виварном контроле) и деструктивно измененных клеток (рис.2), а также общего числа плазматических клеток (2,24% и 2,26%) и макрофагов. Вместе с тем в ПАЛМ в базальном контроле, по сравнению с виварной группой, в 5 раз чаще встречаются бласты (0,59% и 0,11%) и появляются нейтрофилы (0,35%), которые не выявлены в виварном контроле.

Исследование результатов базального контроля показало, что, по сравнению с виварным контролем, авиаперелет на Байконур и обратно, приводит к выраженным изменениям в клеточной структуре центров размножения лимфоидных узелков и в ПАЛМ в селезенке мышей. Выявлено уменьшение деструкции клеток и резкое усиление лимфоцитопоэза в изучаемых морфофункциональных зонах селезенки (увеличение содержания малодифференцированных клеток и клеток с картинами митозов, особенно, в центрах размножения лимфоидных узелков). Установлено, что в селезенке в результате авиаперелета (базальный контроль) в морфологических зонах созревания и формирования В-клеток и в зоне накопления Т-лимфоцитов, отмечается усиление процессов, регулирующих гуморальный и клеточный иммунитет в организме животных [5,10,11].

После 30 суточного космического полета, по сравнению с базальным контролем, в центрах размножения лимфоидных узелков селезенки мышей исчезают клетки с картинами митозов, число бластов уменьшается в 6,9 раза (от 4,14% до 0,60%), больших лимфоцитов - в 2,9 раза (от 13,57% до 4,68%, рис.1). При этом меняется соотношение плазматических клеток (рис.1) - в 1,5 раза увеличивается доля плазмобластов, но резко снижается число зрелых (антителпродуцирующих) плазматических клеток в 4,2 раза (от 1,31% до 0,31%). После космического полета в центрах размножения лимфоидных узелков происходит усиление деструкции клеток (рис. 2), при которой число деструктивно измененных клеток увеличивается в 1,7 раза (от 11,83% до 20,77%) при снижении макрофагальной реакции в 1,4 раза.

В ПАЛМ после космического полета резко уменьшается число малых лимфоцитов (на 10,05%, рис 2.) Среди малодифференцированных клеток исчезают бласты, а число больших лимфоцитов снижено в 2,4 раза (рис. 1). Как и в центрах размножения лимфоидных узелков, в ПАЛМ резко уменьшается общее число плазматических клеток (в 2,6 раза) и, особенно, зрелых плазматических клеток (плазмоцитов) – в 4,2 раза. На фоне значительного (в 2,2 раза) увеличения числа деструктивно измененных клеток (от 11,64% до 25,57%) снижена макрофагальная активность клеток - число макрофагов уменьшается в 1,5 раза. При этом отмечено увеличение содержания нейтрофилов, особенно, их незрелых форм - в 2,3 раза, что в условиях дефицита макрофагов является, видимо, компенсаторной реакцией в организме [2,10].

В результате исследования установлено, что у мышей после космического полета, по сравнению с базальным контролем, происходят резкие нарушения в цитоархитектонике лимфоидной ткани селезенки, которые могут приводить к развитию иммунодефицитного состояния [2,10]. Выявленное в лимфоидных зонах селезенки (в центрах размножения лимфоидных узелков и в ПАЛМ) полное подавление митотической активности клеток на фоне уменьшения бласттрансформации клеток характеризует резкое подавление процессов лимфоцитопоэза в органе [5,11]. Перестройка в соотношении плазматических клеток, как в центрах размножения лимфоидных узелков, так и в ПАЛМ, в сторону уменьшения их зрелых антителпродуцирующих форм (плазмоцитов - в 4,2 раза) свидетельствует о снижении уровня иммуноцитопоэза после космического полета [5, 10]. Вместе с тем, более выраженная деструкция клеток отмечается в ПАЛМ, чем в центрах размножения лимфоидных узелков, при сравнительно равном снижении макрофагальной активности в изучаемых структурах селезенки, что связано, возможно, с угнетением зоны Т-лимфоцитов в селезенке мышей в условиях космического полета. Таким образом, можно сделать вывод, что после 30-суточного полета, по сравнению с базальным контролем, в изучаемых иммунных структурах селезенки наступают столь резкие изменения в кооперации клеток, которые характеризуют резкое снижение лимфоцитопоэза и иммуноцитопоэза на фоне усиления деструкции клеток, что приводит к нарушению гуморального и клеточного иммунитета в организме животных [10,11].

Список литературы

1. Григорьев А.И. Животные в космосе /Григорьев А.И., Ильин Е.А.// Вест. Рос. Академии наук. М., 2007. т.77.- №11.- С. 963-973.

2. Константинова И.В. Система иммунитета в экстремальных условиях. Проблемы космической биологии / Константинова И.В.- М.: Наука, 1989. Т. 59, 288 с.

3. Козловская И.Б. Механизмы влияния невесомости на системы управления жизнеобеспечения организма / Козловская И.Б. //В кн.: Тез. докладов Междунар. конф. по физиологии мышечной деятельности. М.: Изд-во СИП РИА, 2002. с. 10-15.

4. Ларина И.М. Космический полет и регуляция метаболизма у человека /Ларина И.М - М.: Наука, 2004. с. 13-16.

5. GridleyD.S. Changes in Mouse Thymus and Spleen after Return from the STS-135 Mission in Space / GridleyD.S., Mao X.W.,Stodieck L.S. et al. //PLOS ONE, 2013. v.8.- №9.- p. e75097.

6. Григоренко Д.Е. Длительное воздействие гипокинезии на структурную организацию паховых лимфатических узлов обезья / Григоренко Д.Е., Ерофеева Л.М, Корольков В.И., М.Р. Сапин М.Р.// Вестник новых мед. технологий.- 2005. т.12.- №1.- с. 19-21.

7. Григоренко Д.Е. Эффект воздействия гипергравитации на структурно-функциональную организацию лимфоидной ткани селезенки / Григоренко Д.Е., Краснов И.Б., Сапин М.Р. // Морфология. 2003.- т. 123.- № 3. с. 60-64.

8.Alexeev E.L. Pancreatic cell responses to primary and repeated 2G influence / Alexeev E.L., Krasnov I.B. //J. Gravit. Physiol. 2002.- v. 9. № 1.- p. 303-304.

9. Андреев – Андриевский А.А., Шенкман Б.С., Попова А.С., Долгов О.Н. и др. Экспериментальные исследования на мышах по программе полета биоспутника "Бион-М1"/ Андреев – Андриевский А.А., Шенкман Б.С., Попова А.С., Долгов О.Н. и др.// Авиакосмическая и экологическая медицина. 2014.- т.48.- №1. с.14-27.

10. Сапин М.Р. Иммунная система, стресс и иммунодефицит / Сапин М.Р., Никитюк Д.Б. М.: АПП «Джангар». 2000.- 184 с.

11. Gray D. Understanding germinal centre /Gray D. //Res. Immunol. 1991.- v. 142.- p. 236-242.