Мустафина Ш.А., д.в.н. Сарсембаева Н.Б.
Акмолинский областной филиал РГКП «Республиканская ветеринарная
лаборатория» КГИ в АПК МСХ РК, Казахстан
Определение
остаточных количеств антибиотиков
в пищевых яйцах
Вступление
Казахстана в Европейский рынок автоматически приводит к решению вопросов
обеспечения населения высококачественными продуктами питания. Снабжение населения безопасной пищевой продукцией одна
из главных задач развития аграрного сектора республики. Среди комплекса
ветеринарных наук ветеринарно-санитарная экспертиза продуктов птицеводства
является одной из современных направлений этой комплексной науки, направленной
в первую очередь непосредственно на охрану здоровья людей. Поэтому на ветеринарные
лаборатории возложены самые ответственные функции и требуют от специалистов
квалифицированного подхода при проведении исследований.
Среди отраслей сельского хозяйства птицеводство является одним из рентабельных производств. В связи с этим исследования в этой отрасли вызывает большой интерес для практиков в будущем.
На протяжении
десятилетий с целью стимуляции роста птиц, увеличения количества яиц,
профилактики инфекционных и инвазионных заболеваний стремление к повышению
объемов производства и в качестве терапевтических средств применяются
антибиотики довольно широко. При этом чаще всего используются антибиотики
тетрациклиновой группы, левомицетин, стрептомицин, пенициллин, бацитрацин и
т.д.
Определение
содержания антибиотиков необходимо для предотвращения попадания
антибактериальных веществ в продукты питания человека. Потребление продуктов,
содержащих остаточные количества антимикробных веществ, неблагоприятно влияют
на здоровье людей, вызывая аллергические реакции, дисбактериоз. Кроме того,
присутствие антибиотиков в яйцах, мясе, молоке и некоторых других продуктах
ухудшает качество сыров, молочно-кислых изделий и сырокопченных колбас, а также
затрудняет проведение исследований при ветеринарно-санитарной оценке продуктов
животного происхождения .
Таким
образом, задача ветеринарных лабораторий особо актуальна в том, чтобы не допустить попадания продуктов, загрязненных остаточными
количествами антибиотиков в сеть общественного питания. В связи с чем
необходимо знать предельно допустимое содержание антибиотиков в продуктах,
которое не должно превышать для
тетрациклиновой группы –
0,01 ЕД ,
левомицетин - 0,01 ЕД
стрептомицин - 0,5
ЕД
пенициллин - 0,01 ЕД
бацитрацин - 0,02 ЕД на 1 г (мл) продукта.
Для определения антибиотиков в биосубстратах наиболее широкое распространение получили микробиологические методы, позволяющие определить минимальные концентрации антибиотиков в исследуемом материале. Они основаны на непосредственном воздействии антибиотика на чувствительные штаммы микроорганизмов (тест-культур). С их помощью устанавливают наличия антибиотиков в продуктах питания и в различных биологических субстратах.
Наиболее
распроостранен метод диффузии в агар, основанный на свойстве антибиотика
диффундировать из испытуемого образца в плотную питательную среду, засеянную
определенной тест-культурой и подавлять рост этой культуры. В результате вокруг образца появляется зона задержки
роста тест-микроба, свидетельствующая о наличии в образце антибиотика. Величина
зоны зависит от химической природы и концентрации антибиотика, чувствительности
тест-микроба, состава агаризованной среды, рН и других факторов, которые
следует учитывать при разработке и практическом применении метода диффузии в
агар.
Анализ метода диффузии в агар складывается из нескольких этапов.
1.
Выращивание тест-культур и приготовление микробной взвеси.
2.
Подготовка чашек со средой и тест-культурой.
3.
Приготовление растворов рабочего стандарта .
4.
Подготовка испытуемого материала
5.
Постановка опыта.
6.
Учет получения результатов и расчет
содержания антибиотика в испытуемом
материале.
Тест культурами служат специально отобранные, спорообразующие и неспорообразующие непатогенные и условнопатогенные штаммы микроорганизмов, обладающие высокой чувствительностью к антибиотикам. Они должны хорошо расти на применяемых средах, образуя сплошной газон и четко очерченные зоны задержки роста в местах диффузии антибиотика в агар.
Для
количественного и качественного определения антибиотиков в субстратах
используют ряд микроорганизмов.
|
Антибиотик |
Тест-культура |
|
|
Тетрациклины |
Bac.cereus ATCC 1178, Bac.subtilis L2, Bac.Pumilus |
|
|
Пенициллин |
Bac.caliodaktis,St.aureus ATCC 6538, Sarcina lutea ATCC 9341, St.aureus
209-P |
|
|
Стрептомицин |
St.aureus ATCC 6538, Bac.mycoides 538, E.coli
ATCC 9637, Bac.subtilis ATCC 6633 |
||
|
Mономицин |
Bac. Subtilis L2 |
||
|
Левомицетин (хлорамфеникол) |
Bac.cereus ATCC 1178, Bac.subtilis ATCC
6633,Sarcina lutea ATCC 9341 |
||
|
Гризин |
Bac.subtilis ATCC 6633, Bac.subtilis L2 |
||
|
Бацитрацин |
Micrococcus
flavus ATCC 9341 |
||
Тест-культуры
сохраняют на агарных средах в течение 15-30 дней при температуре +4 -10оС,
после чего пересевают на свежую питательную среду.
Для
обеспечения наибольшей чувствительности метода следует вносить минимальное
количество микробных тел, которое еще дает возможность получения сплошного
газона и четко очерченных зон задержки роста.
После
застывания агара в среде пробочным сверлом (с внутренним диаметром 8 мм) при
помощи трафарета под углом 60о друг другу на расстоянии 28 мм от
центра чашки делают 6 отверстий (лунок).
Большинство
антибиотиков в той или иной степени связываются с белками тканей и органов,
поэтому следует иметь в виду, что в яйцах, молоке, меде и других субстратах, полученных
от животных, которые не получали антимикробных препаратов могут присутствовать
вещества, задерживающие рост тест-микроба (естественные ингибиторы).
Испытуемые
яйца, поступившие из хозяйства на исследование, освобождаем от скорлупы
отделяем белки и желтки. Для устранения ингибиторов роста тест-микробов белки
отдельно от желтков подвергаем прогреванию на водяной бане при 60-65 о С
в течении 10-15 минут. Отвешиваем по 10,0 + 0,1 г и приливаем 10,0 +-0,1 мл
буфера соответственно определяемому антибиотику, т.е. при определении
тетрациклинов применяют буфер № 2 – натрий цитрат трехзамещенный – 20,6 г;
соляная кислота концентрированная – 1,81 мл; вода дисциллированная – до 1000
мл.
Подготовленные
пробы помещаем в термостат для экстракции антибиотиков на 90,0+-1 мин при 37оС
, периодически встряхивая содержимое колбочек, после чего смесь прогреваем на
водяной бане при температуре 60о в течение 20 мин.
Пробы
переносим в центрифужные пробирки и центрифугируем при 3000 оборотов в минуту в
течение 10 минут. Надосадочная жидкость является первым разведением /1:2/ и
готова для внесения в лунки. Ко второму разведению /1:4/ приливаем 1,0 мл
буфера соответственно определяемому антибиотику. Затем в подготовленные для
исследований на соответствующий антибиотик чашки Петри вносим контрольное
разведение стандарта, соответствующего определяемому антибиотику по 0,05 мл, а
в три другие вносим такое же количество одного из разведений испытуемых
растворов.
Для
приготовления исходных растворов антибиотиков могут быть использованы стандарты
препаратов с известной активностью. При активности стандарта тетрациклина 850
мкг/мл в 10 мл навески содержится 8500 мкг антибиотика. Для получения первого
разведения основного раствора стандарта антибиотика в 1000 мкг устанавливаем
необходимый объем растворителя: 850х10=8500:1000=8,5 мл. Таким образом, навеску
тетрациклина 10 мг растворяют 8,5 мл 0,01Н HCl и получают концентрацию основного раствора 1000
мкг/мл. Далее основной раствор 1000 мкг/мл разводят десятикратно
цитратно-солянокислым буфером до соответствующей концентрации. Чашки Петри ставим в
термостат на 20+-2 часа при температуре 29+-1,0о при определении
тетрациклинов.
Через 24 часа
замеряем зоны задержки роста тест-культуры и расчитываем среднеарифметическое
значение диаметров зон задержки роста тест-микроба двух параллельных чашек и
наносим его в виде точки на оси абцисс полулогарифмической сетки. Из этой этой
точки восстанавливаем перпендикуляр и проводим до пересечения стандартной
кривой. Через точку пересечения перпендикуляра со стандартной кривой,
параллельно оси абцисс проводим прямую до пересечения с осью ординат .Точка
пересечения параллельной прямой с осью ординат указывает на активность
антибиотика в экстракте исследуемой пробы.
Расчет
содержания остаточных количеств антибиотиков в 1 г исследованного продукта
ведется по формуле: Х=Сх1,5 где
Х – активность
антибиотика в 1 г продукта,
1,5 – степень разведения
пробы буфером, отличная от разведения стандартного гомогената.
Предлагаемый метод обнаружения остаточного
количества антибиотиков в пищевых продуктах в определенной степени облегчает
постановку анализа в лабораториях и позволяет получить достоверные результаты
без особых затрат и дорогостоящего оборудования
Литература:
1.
Зденек Мюллер «Антибиотики в кормлении сельскохозяйственных животных», 1958
г.
2.
Аксенов В.И., В.Ф. Ковалев «Антибиотики
в продуктах животноводства», 1977.
3.
Заиченко А.И. «Методические указания по определению остаточных количеств
антибиотиков в продуктах животноводства» Москва, 1985.
4.
Ковалев В.Ф., Хоменко Н.Р, Справочник «Антибиотики, сульфаниламиды и
нитрофураны в ветеринарии, 1988.