Д.х.н. Болотов В.В., д.ф.н. Безуглий П.О., к.х.н. Маміна О.О.,

к.ф.н. Гарна Н.В., Головченко О.С.

Національний фармацевтичний університет, м. Харків

ВИВЧЕННЯ ВПЛИВУ СТАТИЧНОГО ТА ДИНАМІЧНОГО РЕЖИМІВ НА ПРОЦЕС ЕКСТРАГУВАННЯ ОТРУТ ХЛОРОФОРМОМ З БІОЛОГІЧНОГО МАТЕРІАЛУ

При виборі умов ізолювання отрут з біологічного об´єкту органічним розчинником враховують розподіл отрут в тканинах, зв´язок з білками клітин. Отрути та їх комплекси з білками можуть розчинятись у водному середовищі або у ліпідах завдяки сольватації їх протеїнами або жирами та наявності в тканинах поверхнево-активних речовин.

Згідно з даними літератури найбільш інтенсивно розвиваються методи ізолювання речовин ліпофільними розчинниками та їх різноманітними сумішами з об´єктів дослідження після пробопідготовки - глибокого порушення цілісності клітин та зневоднення. Але ці методики характеризуються багатостадійністю, довготривалістю, втратами речовин на етапах ізолювання; методики розроблені для індивідуальних отрут, а не для груп речовин[1].

Для руйнування клітин та зневоднення тканини печінки при проведенні екстракції отрут хлороформом найбільш оптимальним є застосування безводного натрію сульфату, що підвищує вихід органічних речовин завдяки ефекту висолювання, тобто при зменшенні ступеню їх гідратації та збільшуванні сольватаційних процесів. У той же час при застосуванні натрію сульфату (на відміну від міді (II) сульфату, амонію сульфату) не відмічається змін рН середовища, обумовлених гідролізом солей[2].

Для досліджень нами були застосовані тканини печінки (без ознак гниття) трупів людей, загиблих від травм. Враховуючи різне кровонаповнення органів, можливість різної локалізації жирових включень, відбирали 100,0 г об´єкту, підрібнювали ножицями до розміру часток 0,3-0,5 см, ретельно перемішували, а потім відбирали середні проби об´єкту масою по 5,0-10,0 г.

Вивчення впливу режимів екстракції отрут хлороформом нами проведено із застосуванням дифенгідраміну гідрохлориду, який добре розчиняється в хлороформі як у вигляді солі, так і основи[3].

Підготовлені модельні суміші 5,0 г тканини печінки з 1,0 мл водного розчину дифенгідраміну гідрохлориду, який вміщував 1,0 мг, а також контрольні проби залишали на 24 год при кімнатній температурі. Через добу до проб додавали по 15-20 г безводного натрію сульфату та розтирали у ступці до утворення сипкої маси [1,2].

Нами була проведена порівняльна оцінка результатів статичного та динамічного режимів екстрагування:

► одноступеневої екстракції (мацерації) - після настоювання модельних сумішей тканини печінки з дифенгідраміном гідрохлоридом протягом 1 год з об´ємом хлороформу 100 мл;

► чотириступеневої екстракції (послідовної екстракції) - після настоювання чотири рази по 20 хв з об´ємами хлороформу по 25 мл з наступним фільтуванням через фільтр, змочений хлороформом;

► безперервної екстракції 100 мл хлороформу (зі швидкістю 60-80 крапель у хв) – через скляну колонку 25 см х 1 см, яка заповнена сипкою масою, отриманою при розтиранні біологічного матеріалу з безводним натрію сульфатом.

При виконанні наведених вище методик важливою умовою було створення ефекту «дзеркала», тобто частки біологічного об´єкту повинні бути закритими розчинником під час настоювання при одно- та чотириступеневих екстракціях та при проведенні безперервної екстракції, що обумовлено необхідністю встановлення динамічної рівноваги в системі тканина печінки – хлороформ та сприяє дифузії речовини з біологічного об´єкту у розчинник.

Очищення отриманих екстрактів (об´ємом ~ 90 мл) було нами проведено за наступною методикою[4]: хлороформні витяжки фільтрували через фільтр з 1,0 г безводного натрію сульфату, упарювали на водяній бані до сухого залишку, який розчиняли в 20 мл 0,1 М розчині кислоти хлористоводневої. Домішки тричі екстрагували гексаном порціями по 15 мл, гексанову фазу не досліджували. Водний шар упарювали на водяній бані до сухого залишку, котрий розчиніли у дистильованій воді (двічі по 5-7 мл), після чого кількісно переносили в мірну колбу місткістю 25 мл та доводили до мітки водою.

Кількісне визначення проводили методом екстракційної фотометрії з метиловим оранжевим [1]. Одержані розчини фотометрирували за допомогою фотоелектроколориметру КФК-2, світлофільтр с λ_max 540 ± 10 нм, кювета з товщиною шару рідини 20 мм.

Як розчин порівняння використовували розчин, отриманий при аналізі контрольної проби. Оптична густина розчину порівняння, отриманого з контрольного досліда, не перевищувала 0,05 одиниць оптичної густини.

Розрахунок вмісту дифенгідраміну-основи проводили методом порівняння значень оптичної густини стандартного та досліджуваних розчинів за формулою:

С_х,% = , де

С_{х, %} - масова частка дифенгідраміну-основи в 5 г тканини печінки, в %;

А_х - оптична густина досліджуваного розчину;

С_о – концентрація стандартного розчина (20 мкг/мл);

А_о - оптична густина стандартного розчину (0,508);

25 – об´єм мірної колби з екстрактом речовини із тканини печінки, мл;

а – маса наважки дифенгідраміну гідрохлориду, яка внесена в 5 г печінки, мкг.

Таблиця

Екстракційно-фотометричне визначення дифенгідраміну-основи у хлоро-формних витяжках з тканини печінки (n = 5, Р = 95%)

Методики екстракції дифенгідраміну-основи з тканини печінки	Внесено речовини, мкг	Виділено речовини		Метрологічні характеристики
		мкг	%
Одноступенева екстракція 100 мл після настоювання протягом 1 год	1000,0	457,2	45,7	Х = 48,6 S^2= 5,66; S = 2,38 Sх =1,06; Δх =2,95 ε = ± 6,08 %
	1000,0	472,1	47,2
	1000,0	481,3	48,1
	1000,0	504,9	50,5
	1000,0	515,1	51,5
Чотириступенева екстракція порціями по 25 мл після настоювання по 20 хв	1000,0	559,3	55,9	Х = 59,5 S^2 = 7,29; S= 2,7 Sх =1,21; Δх =3,36 ε = ± 5,65 %
	1000,0	575,4	57,5
	1000,0	602,8	60,3
	1000,0	617,7	61,8
	1000,0	620,2	62,0
Безперервна екстракція об´ємом 100 мл зі швид-кістю - 60-80 крап/хв	1000,0	654,2	65,4	Х = 68,6 S^2 = 6,69; S = 2,59 Sх =1,16; Δх =3,22 ε = ± 4,69 %
	1000,0	667,1	66,7
	1000,0	689,4	68,9
	1000,0	701,9	70,2
	1000,0	717,8	71,8

Результати, наведені в табл., свідчать, що застосування методики безперервної екстракції у колонці (виділено 65,4 – 71,8% дифенгідраміну-основи) практично дорівнює результатам чотириступеневої (56,1 – 62,9 % речовини) екстракції після настоювання, але має переваги у часі виконання (експресна) та включає менше стадій при екстрагуванні речовин.

Встановлено, що більший вихід речовини відмічається при безперервної екстракції в колонці у порівнянні із методикою одноступеневої екстракції (45,7 – 51,6 % речовини), що обумовлено збільшенням площі і часу контакту хлороформу та тканини печінки.

Література

1.Маміна О.О. Порівняльна оцінка методів ізолювання «лікарських» отрут основного характеру з біологічних об´єктів // Фармац.журн.– 2001.– №5.– С.70-74.

2. Маміна О.О. Пробопідготовка при ізолюванні отрут основного та кислотного характеру з тканини печінки трупа хлороформом / О.О.Маміна, В.В. Болотов // Запорожский мед. журн. – 2006.– № 5.– С.38-41.

3. Еремин С.К. Анализ наркотических средств / С.К. Еремин, Б.Н. Изотов, Н.В. Веселовская.– М.: Мысль, 1993. – 259 с.

4. Маміна О.О. Порівняльна оцінка методів очищення хлороформних витяжок з біологічного матеріалу / О.О. Маміна, В.В. Болотов // Фармац. журн. – 2006.– № 5.– С.81-85.