Д.ф.н. Безуглий П.О., д.х.н. Болотов В.В., к.х.н. Маміна О.О.,

к.ф.н. Леонова С.Г., Колісник О.В.

Національний фармацевтичний університет, м. Харків

ВИБІР ОПТИМАЛЬНИХ УМОВ ХРОМАТОГРАФІЧНОГО АНАЛІЗУ АЛКАЛОЇДІВ ПРИ ЇХ СУМІСНІЙ ПРИСУТНОСТІ У БІОЛОГІЧНИХ ОБ´ЄКТАХ

Органічні лікарські речовини загального дослідження при проведенні судово-медичних експертиз (алкалоїди - похідні хіноліну, піридину та піперидину, ізохінолину та ациклічні алкалоїди) широко застосовуються у медичній практиці [1].

В літературі описані чисельні випадки важких та летальних отруєнь алкалоїдами в результаті перевищення доз при самолікуванні, сумісному застосуванні з іншими препаратами та алкоголем, при наркотичній залежності, а також у випадках суїциду [2,3].

Метою даної роботи є вибір оптимальних умов аналізу алкалоїдів при їх сумісній присутності у біологічних об´єктах методом високоефективної рідинної хроматографії на прикладі суміші алкалоїдів, які відрізнялись за будовою - хінін, анабазин, папаверин та ефедрин.

Недоліками наведених в літературних джерелах ВЕРХ-методик аналізу лікарських речовин є застосування різноманітних умов дослідження (склад рухомої фази, ізократичне або градієнтне елюювання, детектування при одній або декількох довжинах хвиль, вибір чутливого та селективного детектору), які базуються на властивостях обмеженої групи отрут[4-6].

Попередні дослідження нами виконані у напрямках вибору органічної фази елюенту (метанол, ацетонітрил), складу та рН буферного розчину (6,0-7,0; 2,0-3,0), застосування іон-парного агента (літію перхлорат), режиму надання елюенту у колонку (ізократичний або градієнтний) при температурі колонки –35 - 37°С; тисненню насосу – 2,6 – 2,8 МПа; об´єму проби для введення– 1-5 мкл (концентрація розчинів речовин - 10-100 мкг/мл) (схема).

Схема

Вибір умов аналізу речовин ВЕРХ-методом

Мікроколоночний рідинний хроматограф “Міліхром А-02”, металева колонка 2х75мм з сорбентом Nucleosil – 100 – 5, C₁₈

Склад рухомої фази та режим надання елюенту у колонку

В результаті досліджень була розроблена ВЕРХ-методика, придатна для ідентифікації, кількісного визначення та скринінгу індивідуальних отрут та їх сумішей у біологічних об´єктах.

При аналізі застосовували багатоканальне детектування речовин за 7 довжинами хвиль – 210, 230, 240, 260, 280, 300 та 330 нм, при цьому кожній речовині на хроматограмі відповідали 7 піків з однаковим часом утримування, але з різними амплитудами, прямо пропорційними екстинкції речовини.

В результаті ВЕРХ-досліджень нами отримані симетричні піки, гострі за формою, що обумовлювало можливість проводити надійну обробку хроматограм (рис.).

Рис. Хроматографічне розділення суміші алкалоїдів, похідних різних

гетероциклів: 1 – анабазину (10,0 мкг/мл); 2 – ефедрину (50,0

мкг/мл); 3 – хініну (25,0 мкг/мл); 4 - папаверину (50,0 мкг/мл).

Ідентифікацію алкалоїдів проводили за параметрами утримування та спектральними відношеннями, які були визначені як відношення значень оптичної густини при 6 довжинах хвиль – від 230 до 330 нм – до значень оптичної густини при 210 нм (табл. 1)[4].

Встановлено, що спектральні відношення при 300 та 330 нм характеризуються низькими значеннями у порівнянні зі спектральними відношеннями при інших довжинах хвиль, що надавало можливості ці дані не враховувати.

Коефіцієнти симетрії піків досліджуваних речовин складали 0,8-1,7, що відповідало оптимальним значенням коефіціентів симетрії піків - менше 2,0 –2,5. Розраховані значення коефіціентів ємності були у межах від 3,33 до 10,55 при оптимальному інтервалі значень коефіціентів ємності – від 2 до 10, що свідчило про придатність хроматографічної системи.

Таблиця 1.

Параметри утримування та спектральні відношення алкалоїдів (n = 5)

Речовини	Параметри утримування речовин			Границя визначення - Gmin, мкг/мл	Коефіцієнт ємності, k´
	tабс, хв		Vабс, мкл (tабс·w)
Анабазин	6,50+0,03		650	1,0	3,33
Ефедрин	9,14 + 0,02		914	2,2	5,09
Папаверин	13,07 + 0,02		1307	1,7	7,71
Хінін	11,36 +0,03		1136	1,6	6,57
Спектральні відношення
	А230 нм А 210 нм	А240 нм А 210 нм		А260 нм А 210 нм	А280 нм А 210 нм
Анабазин	0,114	1,230		1,815	-0,011
Ефедрин	0,002	0,008		0,020	-0,001
Папаверин	0,961	2,802		1,245	0,292
Хінін	0,621	0,936		0,356	0,038

Для оцінки хроматографічного розділення сумішей розраховували: коефіцієнт симетрії піку, селективність, коефіцієнт розділення піків (табл.2).

Встановлено, що практично для досліджуваних речовин селективність складає 1,07-2,35; коефіцієнти розділення піків перевищують 1,0; коефіцієнти симетрії піків не перевищують 2,0.

Таблиця 2

Основні хроматографічні параметри розділення піків алкалоїдів

Речовини	Селективність, α			Коефіцієнт розділення піків, Rs	Число теоретич-них тарілок, n	Коефіцієнт симетрії
Анабазин	-	-	-	-	995	1,07
Ефедрин	1,50-a 3,1	-	-	3,09 - Rs 2,1	1925	1,75
Хінін	1,89-a 3,1	1,26-a 3,2	-	2,40 - Rs 3,2	2855	1,47
Папаверин	2,29-a 4,1	1,53-a 4,2	1,16-a 4,3	2,44 - Rs 4,3	3991	1,50

Таким чином, одержані результати свідчать про придатність вибраних оптимальних умов хроматографування для розділення та аналізу багатокомпонентних сумішей нативних речовин у біологічних об´єктах.

Література

1. Машковский М.Д. Лекарственные средства: в 2-х т., Т.1.– М.: ООО «Изд-во «Новая волна», 2000.– 540с.

2. Randall C. Disposition of Toxic Drugs and Chemicals in Man / Chemical Toxicology Institute.– Foster City, 2000.– 918 p.

3. Fatal blood and tissue concentrations of more than 200 drugs / F. Musshoff, S. Padosch, S. Steinborn et al. // Forensic. Sci. Internation. – 2004.– Vol.142, № 2-3. – P. 161-210.

4. Baram G.I. Portable liguid chromatograph for mobile laboratories // J. Chromatogr. А. – 1996.– Vol.728, № 3. – P.387-399.

5. High perfomance liquid chromatography in pharmaceutical analyses / B. Nicolin, B. Imamovic, S. Medanhodzic-Vuk, M. Sober // Bosn J. Basic Med. Sci. – 2004. - Vol. 4, № 2. – P. 5-9.

6. Herzler M. Selectivity of substance identification by HPLC-DAD in toxicological analysis using a UV spectra library of 2682 compounds // J. Anal. Toxicol. – 2003.- Vol.27, № 4. – P. 233-242.