Л.Л. Беляева, Л.Р. Валиуллин, Э.И. Семенов,
Е.Ю. Тарасова, О.К. Ермолаева
ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и
биологической безопасности» (ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ») г. Казань
МЕТОД КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА: ВОЗМОЖНОСТИ И ПЕРСПЕКТИВЫ
Капиллярный электрофорез
– КЭ – метод разделения, реализуемый в капиллярах и основанный на различиях в
электроннофоретических подвижностях заряженных частиц, как в водных, так и в
неводных буферных электролитах. Главные достоинства метода – высокая эффективность (миллионы т.т.) малый объем дозы
(нл), значительно более простая процедура пробоподготовки, возможности online детектирования и концентрирования. Чувствительность лазериндуцированного
флуоресцентного (ЛИФ) детектирования в сочетании с различными приемами online приемами концентрирования пробы позволяет
использовать КЭ для анализа предельно малых количеств вещества (10-16-10-21
М) нейтральных и ионогенных
аналитов с широким диапазоном молекулярных масс. И как перспективный метод
вещественного анализа его широко применяют на практике для решения самых
разнообразных задач, в том числе, для изучения природных и биологических систем
[1].
Для поддержания здоровья
сельскохозяйственных животных и их научно-обоснованного кормления необходим
баланс аминокислот (АК), витаминов, органических и неорганических анионов и
катионов. Разработаны методики 1) прямого определения технологически важных АК
(Lys, Met, Thr,
Cys-Cys, Trp) и определения всех
20-ти протеиногенных аминокислот в форме фенилтиокарбамильных производных, 2)
определения кормовых (синтети-
ческих) аминокислот с временем анализа
не более 5-8 мин и в отсутствие подготовки пробы, 3) серосодержащих аминокислот, являющихся балансируемыми
показателями при кормлении сельскохозяйственных животных и птицы [2].
Разработана также методика определения 12-ти водорастворимых витаминов в зонном
и мицеллярном вариантах КЭ. Принципиально разная стабильность аналитов в водных
растворах в зависимости от величины рН позволила предложить на этапе подготовки
пробы единую для всех витаминов экстракционную смесь (раствор тетрабората
натрия в присутствии сульфит –иона), при этом результаты для фолиевой кислоты,
витаминов С и В2 рекомендовано
оценивать полуколичественно. Кроме того предложены варианты определения в
водной вытяжке кормов и растительного сырья хлоридов, нитритов, нитратов, а
также масляной, молочной и уксусной кислот. Знание состава и соотношения
органических кислот позволяет, в частности, оценивать сроки хранения силоса и
возможность его использования в качестве кормовой добавки. Дальнейшие
перспективы применения метода капиллярного
электрофореза в АПК связаны с определением элементного состава кормов,
минеральных концентратов и солей (железо, медь, марганец, кобальт и др.), где
он может успешно конкурировать с одноэлементным и дорогостоящим определением
методом ААС. Метод КЭ разработан также
для контроля качества комбикормов,
которые, как правило, включают до 15 кормовых компонентов и различных добавок,
соли микроэлементов, биологические активные добавки такие как жиро- и
водорастворимые витамины, и основные протеолитические незаменимые аминокислоты
(лизин, метионин, треонин) и наполнителя (мел, известняк, отруби и т.д.) [3].
Одним из самых дорогостоящих компонентов
комбикорма для сельскохозяйственных животных и птицы, обеспечивающим в конечном
продукте определенную долю содержания протеина и, соответственно, аминокислот
является рыбная мука. Поэтому данный продукт фальсифицируют другими различными
добавками, например, жмыхом подсолнечным, продуктами химического производства
(меламин), различными азотосодержащими минеральными удобрениями, в том числе и
мочевиной и т.д. В этом случае
доказательством качества продукции является определение массовой доли заменимых
и незаменимых аминокислот [4]. КЭ использовали также для исследования
флавоноидов в широко распространенной кормовой культуре - рапсе. и для оперативного определения
качества силоса, а именно, для анализа в нем органических кислот: молочной,
уксусной, масляной, щавелевой, муравьиной, яблочной и пропионовой, что может быть использовано при селекции кормов на
качество, заготовке объемистых кормов и учитываться в рационах животных [4,5].
Возможности КЭ
показаны для контроля качества
продукции молочной промышленности для определения концентраций катионов
щелочных металлов, анионов сильных минеральных кислот, органических кислот в
молоке и молочных продуктах, содержание которых является косвенным указанием на фальсификацию этой
продукции и для контроля качества сыров
и творожных продуктов [6]. Метод был усовершенствован для определения гидроксикарбоновых кислот в
продуктах питания-яблоках, апельсинах, в яблочно-виноградных соках, в квасе,
пиве и винах [7].
В настоящее время с
помощью систем капиллярного электрофореза «Капель» проводят анализ питьевых,
природных и сточных вод, вин и винопродукции, спиртных напитков, соковой
продукции, безалкагольных напитков, минеральных и столовых вод пивоваренной
продукции, пищевых продуктов; кофе, кофепродуктов, чая и какао, БАД с целью
определения следующих компонентов: неорганических катионов и анионов,
консервантов, подсластителей,
усилителей вкуса, антиоксидантов и синтетических пищевых красителей, кофеина,
теобромина, катехинов, органических и фенолкарбоновых кислот, ароматических
альдегидов, сахаров, биофлаваноидов, аминокислот и водорастворимых витаминов,
меламина, хмелевых и горьких пивных кислот, аминов, таурина и карнитина [8].
При анализе коньячной продукции определяют ароматические альдегиды: ванилина, кониферилового, синапового, сиреневого.
Максимально обнаруживаемая концентрация альдегидов равна 0,05 мг/дм3 с
постоянной линейностью до 50 мг/дм3 включительно [8,9].
КЭ используют для
идентификации показателей соковой продукции, в том числе в целях выявления фальсификаций
определяют лимонную, яблочную, молочную, янтарную и другие органические
кислоты. Время анализа не превышает 5
минут, определению не мешают неорганические анионы, одновременно можно
определять консервант – сорбиновую кислоту.. Для предотвращения фальсификации
цитрусовой соковой продукции введены ограничения на концентрации нарингина в
грейпфрутовом и лимонном соках, гесперидина в апельсиновом, мандариновом и
лимонном соках, поэтому создана методика прямого определения данных флаваноидов
с использованием метода капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ).
Дополнительным иденти-фикационным показателем натуральности соковой продукции
является содержание минеральных веществ, особенно катионов калия. Разработаны
методики КЭ определения калия, натрия,
магния и кальция в напитках и соках, предполагающее косвенное детектирование
при длине волны 254 нм., определены (щелочные и щелочноземельные металлы, смеси
сахаров, сорбиновой кислоты, яблочной, винных,
янтарной кислот, синтетических красителей, кофеина, аскорбиновой
кислоты, консервантов, и подсластителей. Метод успешно применен для прямого
определения глюкозы, сахарозы и фруктозы, а также для определения массовых
концентраций ароматических альдегидов и фенолкарбоновых кислот и общего фосфора
в коньячных спиртах и коньяках [10].
КЭ применяют также для изучения природных и биологических
систем (микро и макрокомпонентов в объектах окружающей среды (природных и
техногенных водах, водных вытяжках из почв и донных осадков) и биологических
системах (биосубстратах млекопитающих), для определения анионов в природных
водах различного происхождения (снеготалых, поверхностных, минеральных и
вулканических), а также в шахтных водах и поровых водах хвостохранилищ на
уровне содержаний от 0,01 до 50 мг/л.
Для целей медицинского
контроля предложен экспресс-анализ сыворотки крови на содержание эссенциальных
компонентов катионного характера и определения ацетатиона на уровне 100 - 10000
мкмоль/л при изучении динамики его изменения у пациентов, подвергшихся
процедурам гемодиализа. А также для количественной оценки субстратов,
участвующих при функциональных нарушениях нервной системы вследствие
образования в них активных форм кислорода при окислительном фосфорилировании в
митохондриях. КЭ используют для определения низкомолекулярных карбоновых кислот
– метаболитов цикла Кребса: лимонной, янтарной, яблочной, пировиноградной и
глутаминовой в митохондральных экстрактах тканей млекопитающих на уровне их
содержания 0,01-20 мг/л [11].
Метод является
альтернативным для отбора аптамеров, что позволяет: 1) проводить
измерение кинетических и термодинамических параметров лиганд белковых
взаимодействий; 2) осуществлять количественный аффинный анализ белков и
гибридизационный анализ молекул ДНК и РНК, 3) использовать нанолитровые
количества анализируемых смесей, 4) получать высокоаффинные ДНК-аптамеры к
белку – caspase-7. Данное семейство белков играет важную роль в
процессах аппоптоза, некроза и воспалительных процессах [12]. Актуальным
направлением метода, особенно в области фармацевтических, биологических и
агрохимических объектов является разделение изомеров (энантиомеров) оптически
активных соединений. При добавлении в фоновый электролит МА или
пер-6-амино-β-ЦД были успешно
разделены энантиомеры кетопрофена, ибупрофена, фенопрофена, флурбипрофена,
индопрофена и миндальной,
α-метоксиуксусной, 2-фенилпропановой, 3-фенилбутановой кислот, а
также N-карбоксибензоил-, трет- бутоксикарбонил – и
дансил-производных аминокислот [13].
В соответствии с
Европейской Фармакопеей изд. 6,0 (ЕФ)
методом используемым для определения изоформенного состава эритропоэтина-белка
гормональной природы (ЭПО), является капиллярный электрофорез. ЭПО успешно
применяется для лечения различных форм анемии и может существовать в виде
многих изоформ, количество и состав которых играет ключевую роль в активности,
стабильности и биологической доступности лекарственного препарата. Поэтому
детальная характеризация изоформ белка является необходимым этапом.
Эффективность разделения в данном методе достигает сотен тысяч теоретических
тарелок при минимальной пробоподготовке и обладает устойчивостью к посторонним
примесям в пробе и низкой себестоимостью анализа [14]. КЭ предложено
использовать для определения чистоты биопрепарата L-лизин-А-оксидазы,
полученным из триходермы и являющийся антиопухолевым, антивирусным и
антибактериальным препаратом. Впервые были получены электрофореграммы L-
лизин-А-оксидазы в фосфатных (2мМ) буферных растворах с рН 5,6; 7,4; 8,6.
Идентифицированы положения пиков лизина, L-лизин-оксидазы и
аммонийной соли А-кето-аминокапроновой
кислоты – έ-аминокапроновой
кислоты [15].
Метод капиллярной
электрохроматографии также является одним из перспективных, развиваемых в
настоящее время направлений - создание экспрессных методов
высокочувствительного и селективного определения белков и пептидов, позволяющий
с высокой разрешающей способностью разделять близкие по структуре компоненты в
сложных матрицах. Исследованы аналитические возможности усовершенствованных капиллярных колонок для
разделения белков (лизоцим, миоглобин, альбумин, инсулин) [16]. Представлены
результаты исследований по созданию методик анализа смеси аминокислот, меченных
флуоресцентной меткой методом
капиллярного зонного электрофореза на стеклянном микрофлюидном чипе [17].
Актуальным является исследование субстратной специфичности фермента
аминотрансфераза Б (КФ 2.6.1.42, ВСАТ), которая участвует в биосинтезе
разветвленных аминокислот, относительно природного субстрата (изолейцина,
Ιle) и его диастереомера (аллоизолейцина, а Ιle).
На основе проведенных исследований предложен способ определения анионов
2-оксо-3- метилвалериата и глутамата в реакционных смесях для работы с
очищенным ферментным препаратом и грубыми клеточными экстрактами [18]. Метод капиллярного электрофореза
является альтернативным для определения пестицидов и микотоксинов:. охратоксина
А, патулина и пестицидов группы триазолов: пенконазола, флутриафола,
триадименола и тебуконазола в виноградных винах и виноматериалах. Преимущество
капиллярного электрофореза при определении микотоксинов и микроколичеств
триазолов заключается в высокой эффективности разделения компонентов, малых
объемов анализируемой пробы буферного раствора, экспрессности анализа, в
повышении безопасности аналитика за счет уменьшения расхода высокочистых токсичных растворителей, в
отсутствии дорогостоящих хроматографических колонок, насосов, необходимых для
ВЭЖХ и упрощенной пробоподготовки вина
и виноматериалов для анализа по сравнению с ГЖХ, ВЭЖХ и ТСХ [19]. Метод КЭ
продолжает развиваться и усовершенствоваться в связи с новыми возможностями его
применения. Дальнейший прогресс микросепарационной техники связан с созданием
чип-приборов КЭ, использование более узких и коротких кварцевых капилляров
(5-10 мкм и 1-5 см) [20]. Практическую
значимость метода подтверждают действующие и разрабатываемые ГОСТ Р для
различных испытаний промышленной, пищевой и сельскохозяйственной продукции для
индикации концентраций от 5 до 500 мг/дм3[21].
Литература:
1.
Карцова
Л.А. Тенденции и подходы в методе капиллярного электрофореза и родственных
методах. (Капиллярный электрофорез. Современное состояние и перспективы. С.233
2.
Тимербаев
А.Р., Фотеева Л.С., Алексеенко С.С. Капилляр; только ли средство для разделения
в электрофорезе. С.238
3.
Морозова
О.В., Комарова Н.В., Адамсон В.Г., Софронова С.С. Применение метода
капиллярного электрофореза для идентификации показателей соковой продукции, в
том числе в целях выявления фальсификации. С.261
4.
Воронкова
Ф.В., Мамаева М. В. Методическая и практическая необходимость определения
метионина в кормах в виде его оксисоединений методом капиллярного
электрофореза. С. 260
5.
Страшилина
Н.Ю., Калач А.В. Оценка аминокислотного состава рыбной муки методом
капиллярного электрофореза. С. 249.
6.
Гаврилин
М.В., Съедин А.В., Сенченко С.П. Изучение химического состава надземной части
рапса обыкновенного с использованием методов ВЭЖХ и капиллярного электрофореза.
С. 229
7.
Мудрикова О.В., Просеков А.Ю. Применение
капиллярного электрофореза для контроля качества продукции молочной
промышленности.с.245
8.
Голубенко
А.М., Никоноров В.В., Никитина Т.Г. Определение гидрокарбоновых кислот в
продуктах питания методом капиллярного электрофореза. С.252
9.
Адамсон
В.Г., Комарова Н.В.,Софронова С.С. Возможности метода капиллярного
электрофореза для комплексного анализа кормов, комбикормов и сырья для их
производства. С.266
10.
Гаврилюк В.В., Ложникова М.С., Якуба Ю.Ф.
Применение капиллярного электрофореза для анализа коньячной продукции. C.258
11.
Шуваева О.В., Полякова Е.В., Ярославцев Д.А.,
Романова Т.Е. Применение капиллярного электрофореза в анализе природных и
биологических объектов. C.243
12.
Шкурина Е.Е., Ефимов Р.В., Использование
капиллярного электрофореза для биомолекулярного скрининга аптамеров. с.241
13.
Шаповалова Е.Н., Прохорова А.Ф., Ананьева
И.А. Катионные хиральные селекторы в капиллярном электрофорезе и
высокоэффективной жидкостной хроматографии. С.264
14.
Лобанова Н.В., Лебедев М.Ю., Гремяков А.иИ,
Егоров П.А. Использование метода капиллярного электрофореза для определения
изоформенного эритропоэтина. с.257
15.
Руднев А.В., Шкинев В.М., Смирнова И.П.,
Кузовников А.Е. Капиллярный электрофорез как инструмент для изучения
каталитической активности L-лизина-А-оксидазы. с.269
16.
Бессонова Е.А., Карцова Л.А., Поликарпов
Н.А., Потолицина В.Е. Капиллярный электрофорез белков с использованием
полиметакрилатных и дендримерных колонок. с. 32
17.
Евстрапов А.А., Буляница А.Л., Лукашенко
Т.А., Рудницкая Г.Е., с. 276
18.
Новикова А.Е.. Киверо А.Д., Физер К.В.,
Стойнова Н.В. Использование капиллярного электрофореза и ВЭЖХ для определения
продуктов аминотрасферазы в реакционных смесях. с. 250
19.
Марковский, М.Г. Быстрое определение
триазольных пестицидов в продуктах виноделия методом капипилярного
электрофореза/ М.Г.Марковский, М.В.Антоненко//Оптимальные технологоэкономические
параметры биолого-технологических систем; Сб. матер. по основным итогам научн. исследований за 2007 год. –
Краснодар, Изд-во ГНУ СКЗНИИСиВ, 2008.
– С. 358- 360.
20.
Комарова Н.В. Возможности и перспективы
метода капиллярного электрофореза при решении задач аналитической службы
России. Комарова Н.В, Каменцев Я.С. Практическое руководство по использованию
систем капиллярного электрофореза «Капель» Санкт-Петербург, 2008. С. 207
21.
Доклады,
представленные на Х1Х Менделеевском съезде. Секция 7. Волгоград. 25-30 сентября
20011 г. Авторы: С.17, 323. Доклады,
представленные на Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и
капиллярный элктрофорез, Краснодар, 26 сентября-01 октября, 2010 г.