Сельское хозяйство/4. Технологии хранения и переработки сельскохозяйственной продукции

Канд. техн. наук Е.В. Кушнерева,

канд. техн. наук Марковский М.Г.,

д-р с.-х. наук, профессор, Гугучкина Т.И.,

д-р техн. наук, профессор, Агеева Н.М.

Государственное научное учреждение Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский институт садоводства и виноградарства Россельхозакадемии

МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ БИОГЕННЫХ АМИНОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

1. Введение

Основываясь на литературных данных можно сделать заключение о том, что биогенные амины являются продуктами микробного декарбоксилирования аминокислот, оказывают как положительное, так и отрицательное воздействие на организм человека, и могут выступать в качестве маркера качества пищевого продукта. Гистамин, серотонин, допамин и тирамин обладают большой биологической активностью [1], спермин, спермидин и кадаверин участвуют в регуляции роста клеток организма, катехоламины и серотонин играют большую роль в нейронных передачах между клетками организма,  гистамин и тирамин выступают в качестве медиаторов воспаления[2].

По своей природе биогенные амины являются азотсодержащими соединениями, с алифатической (путресцин, кадаверин, спермин, спермидин), ароматической (тирамин, фенилэтиламин) или гетероциклической (гистамин, триптамина) структурой.

Присутствие биогенных аминов в пищевых продуктах представляет потенциальную угрозу жизни и здоровью человека из-за их токсических свойств. Например, тирамин и 2-фенилэтиламин вызывает мигрени, путресцин, кадаверин   способны вызвать гипотонию, брадикардию, спазм жевательных мышц, паралич конечностей [3].  Высокие концентрации этих веществ в пищевых продуктах образуются в результате не соблюдения основных правил и санитарных норм технологического процесса производства, как следствие использования сырья и материалов плохого качества [4].

         Вопросу формирования и накоплению биогенных аминов в пищевых продуктах посвящено много научных работ  [5-9] .

Для идентификации и количественного анализа биогенных аминов в пищевых продуктах разработаны различные методы: тонкослойная хроматография,  капиллярный электрофорез, высокоэффективная жидкостная хроматография, хроматомассспектрометрия.  Метод определения биогенных аминов в пищевых продуктах с помощью мицеллярной электрокинетической капиллярной хроматографии был разработан и предложен в 1997 г [10]. Метод предполагает разделение биогенных аминов с помощью AccQ (6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamata). Авторами было исследовано влияние состава буфера на разделение биогенных аминов (в том числе рН, концентрации и различных добавок). Разработанная методика позволяет проводить разделение семи биогенные амины (гистамин, тирамин, триптамина, спермин, спермидин, кадаверина и путресцин) в течение 25-30 мин с хорошей сходимостью.

Метод хроматомассспектрометрии в режиме ионн-мониторинга с использованием в качестве реактива гептафтормасляного ангидрида был разработан для определения биогенных аминов в винах [11].

Авторы [12] предложили комбинированный метод определения с помощью инно-двойной экстракции и газовой масс-спектрометрии для одновременного определения диаминов, полиаминов и ароматических аминов в вине и виноградном соке. Этот метод отличается точностью и высокой чувствительностью, предназначен для одновременного определения диаминов (1,3 -диаминопропана, путресцина и кадаверина), полиаминов (спермидин и спермин), и ароматических аминов (B-фенилэтиламин и тирамин) в винах и виноградных соках. Принцип очистки состоял из ионно-спаривания аминов с реагентом бис-2-этилгексилфосфат, затем растворением в хлороформе и обратно экстрагировнием с помощью 0,1 М HCl. Соляной полученный экстракт высушивали и производные аминов с гептафтормасляным ангидридом идентифицировали с помощью ГХ-МС в выбранном режиме ионно-мониторинга с общим временем анализа 18 мин. Полученные экстракты были свободны от потенциальных помех: сахара, аминокислот и полифенолов.  Были пользованы наборы из пяти выбранных внутренних стандартов (амфетамин, путресцин, 1,7-диаминогептан, 8 спермидин и спермин).

В 2004г. авторы [13] предложили метод идентификации 8 биогенных аминов с помощью  тонкослойной хроматографии, с использованием системы растворителей хлороформ - диэтиловый эфир-триэтиламина (6:04:01), а затем хлороформ-триэтиламина (6:1). Количественное определение этих аминов проводили денситометрически при 254 нм по методике [11].

Определение биогенных аминов в пиве методом капиллярного электрофореза с лазерно-индуцированной флуоресценцией [14] пощволяет идентифицировать одновременно 10 биогенных аминов, которые обычно образуются в пиве. Принцип метода заключается в том, что амины переводят в производные, фильтруют, а затем идентифицруют в присутствии 50 мМ бората натрия и 20% ацетона при рН 9,3 при 30 кВ. Время анализа составляет 30 мин.

Согласно Резолюции МОВВ 4/97, начиная с 1997 г. Международной организацией винограда и вина ведутся исследования, направленные на выяснения причины образования биогенных аминов в вине, а также подбор методов идентификации биогенных аминов. В 2009-2010гг МОВВ приняла Резолюции 346 и 348, в которых изложены основные принципы и порядок анализа содержания биогенных аминов в виноградном сусле и вине методом тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографией.

Разработанный и принятый МОВВ метод тонкослойной хроматографии определяет способность производить биогенные амины (БА) бактериями в жидких питательных средах, содержащих соответствующие предшественники аминокислот. Метод позволяет выделять и идентифицировать гистамин (HIS), тирамин (TYR), путресцин (PUT), кадаверин (CAD) и фенилэтиламин (РЕА) с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ).

Сущность метода заключается в том, что амины фракционируют на силикагеле пластины и разделяют в системе хлороформ: триэтиламин. Пятна визуализируются в УФ-с помощью трансиллюминатора.

Идентификация биогенных аминов с помощью предложенного МОВВ метода высокоэффективной жидкостной хроматографии осуществляется на колонке С18 с помощью дериватизации о-фталальдегидом и флюориметрическим детектором.

Недостатками предложенных МОВВ методов является высокая стоимость и ресурсоемкость. Проведенные нами исследования позволили разработать метод идентификации биогенных аминов с применением капиллярного электрофореза с предварительной твердофазной экстракцией аминов [15]. Метод устанавливает процедуру качественного и количественного определения содержания биогенных аминов в винодельческой продукции посредством капиллярного электрофореза.

Диапазон измерений массовых концентраций биогенных аминов (аммиак, путресцин, метиламин, кадаверин, диметиламин, этиламин, этаноламин, пирролидин, пропиламин, изопропиламин, изобутиламин, изоамиламин, фенилэтиламин) составляет от 0,1 до 200 мг/дм3 включительно.

Метод базируется на разделении биогенных аминов с помощью твердофазной экстракции на патронах С18 и идентификации в растворе элюента с помощью метода капиллярного электрофореза на высокоточном приборе «Капель 105Р», оборудованном ультрафиолетовым детектором, с длинной волны лампы 254 нм и следующими характеристиками: кварцевый капилляр, длиной 0,5 м до детектора, внутренним диаметром 75x 10-6 м; регулируемый источник высокого напряжения положительной полярности 3-25 кВ;  пневматический и электрический ввод пробы; принудительное воздушное охлаждение капилляра.

         Преимущества метода капиллярного электрофореза заключаются в высокой эффективности разделения компонентов, экспрессности, точности и  высокой воспроизводимости. 

Литература

  1. Shalaby, A. R. Significance of biogenic amines to food safety and human health. Food Research International, 1996. - № 29. – Р. 675–690.
  2. Tabor, C. W., & Tabor, H. Polyamines. Annual Review of Biochemistry.- 1976. - № 53.- 749–790.
  3. Морковникова, М. Биогенные амины как показатель качества процесса пивоварения/ М. Марковникова, А. Белодедова//Индустрия напитков. -2009. - №5.-С.20-23.
  4. Brink, B. T., Damink, C., Joosten, H., & Huis in’t Veld, J. (1990). Occurrence and formation of biologically active amines in foods. International Journal of Food Microbiology, 11, 73–84.
  5. Davı´dek, T., & Davı´dek, J. (Eds.). (1995). Biogenic amines in natural toxic compounds of foods (pp. 108). Boca Raton: CRC Press.
  6.  Halasz, A., Barath, A., Simon-Sarkadi, L., & Holzapfel, W. (1994). Biogenic-amines and their production by microorganisms in food. Trends in Food Science and Technology, 5, Р.42–49.
  7.  Silla Santos, M. H. Biogenic amines: their importance in foods. International Journal Food Microbiology.- 1996. - № 29. – Р. 213–231.
  8.  Stratton, J. E., Hutkins, R. W., & Taylor, S. L. (1991). Biogenic-amines in cheese and other fermented foods – a review. Journal of Food Protection, 54, 460–470.
  9.  Suzzi, G., & Gardini, F. (2003). Biogenic amines in dry fermented sausages: a review. International Journal of Food Microbiology, 88, 41–54.
  10. Lourdes Arce, Angel R.ıos, Miguel Valca. Direct determination of biogenic amines in wine by integrating continuous flow clean-up and capillary electrophoresis with indirect UV detection/ Journal of Chromatography A, 803 (1998) 249–260
  11. Shalaby, A. R. (1999). Simple, rapid and valid thin layer chromatographic method for determining biogenic amines in foods. Food Chemistry, 65, 117–121.
  12. Lapa-Guimaraes, J., & Pickova, J. (2004). New solvent systems for thinlayer chromatographic determination of nine biogenic amines in fish and squid. Journal of Chromatography A, 1045, 223–232.

13.  Fernandes, J. O., & Ferreira, M. A. (2000). Combined ion-pair extraction and gas chromatography–mass spectrometry for the simultaneous determination of diamines, polyamines and aromatic amines in Port wine and grape juice. Journal of Chromatography A, 886, 183–195.

14.  S. Cortacero-Ramı.rez, D. Arra.ez-Roma.n, A. Segura-Carretero, A. Ferna.ndez-Gutie.rrez Determination of biogenic amines in beers and brewing-processsamples by capillary electrophoresis coupled to laser-induced fluorescence detection/ Food Chemistry 100 (2007) 383–389.

15.  Кушнерева, Е.В. Риски, связанные с развитием молочнокислых бактерий в вине/ Е.В. Кушнерева, Н.М. Агеева // Сб. науч. тр. X Международ. науч.-практ. конф. молодых ученых и специалистов «Современные достижения в виноградарстве и виноделии» НИВиВ «Магарач». – Том XLI.– Ч 2. –Ялта, 2011. – С. 55-57.