УДК 619:579.873.21 (571.56)

Новый способ подавления патогенных свойств микобактерий туберкулеза

 

М.П. Неустроев, доктор ветеринарных наук,

ГНУ Якутский НИИ сельского хозяйства Россельхозакадемии,

Н.П. Тарабукина, доктор ветеринарных наук,

ГНУ Якутский НИИ сельского хозяйства Россельхозакадемии,

Г.П. Протодьяконова, кандидат ветеринарных наук,

ФГБОУ ВПО «Якутская государственная сельскохозяйственная академия»

Наукой и практикой достигнуты определенные успехи в борьбе с туберкулезом сельскохозяйственных животных, однако, эта инфекция остается одной из ведущих, наиболее сложных и экономически значимых в инфекционной патологии.

  Общеизвестно, что микобактерии туберкулеза относятся к высоко устойчивым бактериям за счет особенностей строения клетки, в частности, клеточной стенки. Основным фактором патогенности микобактерий является корд-фактор, благодаря которому вирулентные микобактерии склеиваются и растут в виде «кос» или «жгутов». 

  Нами изучена в эксперименте in vitro и in vivo возможность использования с антагонистической целью пробиотиков из споровых бацилл при туберкулезной инфекции. Применение пробиотиков при туберкулезе животных обосновано тем, что заражение в основном происходит алиментарно и микрофлора кишечника во многом определяет резистентность организма к различным патогенным микроорганизмам и состояние иммунитета в целом. Перспективно применение пробиотиков и в медицине у инфицированных детей, принимающих большое количество химиопрепаратов и естественно имеющих дисбаланс в микробиоценозе кишечника и тем самым нарушения иммунного ответа организма [1-3].

В настоящее время интерес к эффективным и безопасным пробиотическим препаратам возрос как альтернативы антибиотикам. Применение пробиотиков является общепринятым методом коррекции дисбиотических нарушений, т.к. пробиотики при естественном способе применения оказывают положительный эффект на физиологические, биохимические и иммунные реакции организма путем стабилизации и оптимизации функций его нормальной микрофлоры [4-5]. 

Из мерзлотных почв Якутии выделены споровые микробы, которые послужили основой конструирования пробиотиков, обладающих выраженной антагонистической активностью по отношению многих патогенных и условно-патогенных бактерий, по своей природе являющихся высокоустойчивыми и биологически наиболее активными [5].

Цель исследований – изучить антагонистическое действие пробиотических штаммов бактерий Bacillus subtilis ТНП-3 и  Bacillus subtilis ТНП-5 и их сочетания (препарат – пробиотик Сахабактисубтил) на биологические свойства микобактерий туберкулеза в опытах in vitro и in vivo.

Материалы и методы исследований:

В опытах использовали суспензии штаммов бактерий Bacillus subtilis ТНП - 3 и Bacillus subtilis ТНП - 5 с содержанием 5х109 КОЕ /мл и пробиотик «Сахабактисубтил» (утв. Россельхознадзором МСХ РФ, 14.11.2006 г.). Препарат Сахабактисубтил состоит из штаммов бактерий Bacillus subtilis ТНП-3 и  Bacillus subtilis ТНП-5, выращенных на плотной питательной среде и суспензированных в равных соотношениях в изотоническом растворе хлорида натрия.  В 1 мл препарата содержится не менее 5 млрд. колониеобразующих единиц Bacillus subtilis. Препарат представляет собой прозрачную жидкость светло-бежевого цвета со светлым осадком, легко разбивающимся в равномерную взвесь.

В качестве тест-культуры были использованы – вирулентный штамм М. tuberculosis № 492, выделенный от больного в Якутском НИИ туберкулеза и вирулентный штамм М. bovis штамм 14х ВНИИБТЖ, выращенные на среде Финн-2.

Для опытов посев штаммов производили в среду Школьниковой. Пробиотические штаммы и пробиотик Сахабактисубтил добавляли в объеме 1 мл в дозе 5х108КОЕ. Тест-штамм микобактерий туберкулеза (МБТ) засевали в дозе 5х108КОЕ в объеме 1 мл. В контрольные пробирки засевали только МБТ. Посевы инкубировали в термостате при температуре 37°С. Посевы слегка встряхивали, перемешивали и готовили мазки, окрашивали по Цилю-Нильсену и проводили микроскопию с масляной иммерсией. Использовали микроскоп «Микмед 6», увеличение ×1000. Фотографирование производили цифровой камерой микроскопа – модели DСМ 500 с помощью программы MiniSee. Мазки готовили в день посева, на 3, 6, 8, 12, 14, 16, 20, 23 и на 26-й день наблюдения.

Для изучения антагонистического воздействия пробиотика «Сахабактисубтил» на микобактерии туберкулеза в организме, опыт был поставлен в условиях вивария на белых беспородных мышах.

В качестве тест-культур использованы: 1) 3-4-недельная культура М.bovis (штамм 14х ВНИИБТЖ), выращенная на среде Финн-2; 2) 15–20-дневная культура М.bovis после совместного выращивания  с пробиотиком на питательной среде Школьниковой (оптимальный срок, когда в контроле образуется корд-фактор).

Мышей заражали введением подкожно в область паха культуры M. bovis - штамм 14х ВНИИБТЖ в дозе 5х108 КОЕ/мл.

Пробиотик «Сахабактисубтил» давали опытным группам перорально в дозе 5х109КОЕ в 0,1 мл физраствора.

Результаты исследований  их обсуждение.

В мазках из контрольных пробирок в первые дни микобактерии туберкулеза расположены поодиночно, затем располагаются попарно, кучей, образуют короткие нити, которые постепенно утолщаются и удлиняются.

Пробиотик Сахабактисубтил изготовлен из грамположительных, спорообразующих аэробных бактерий. В мазках, окрашенных по Цилю-Нильсену,  штаммы бактерий Bacillus subtilis ТНП-3 и  Bacillus subtilis ТНП-5 представлены в виде спор округлой формы, окрашенные в синезеленый цвет метиленовым синим. Спорообразование у пробиотических штаммов бактерий связано с воздействием высокой температуры при окрашивании, протравливанием кислотой и спиртом.

Корд-фактор в контрольных пробирках с МБТ человеческого и бычьего видов наглядно образуется на 14-й день выращивания на жидкой  питательной среде Школьниковой.

В опытных пробирках широко представлены спорообразующие бактерии Bacillus subtilis синеватого цвета. Микобактерии туберкулеза, окрашенные карболовым фуксином в малиново-красный цвет, находятся в их окружении, и количество их не увеличивается до конца наблюдения.

Следует отметить, что наиболее выраженным антагонистическим действием на МБТ обладают штаммы бактерий Bacillus subtilis ТНП – 3.

Таким образом, в опытах in vitro установлено, что испытанные штаммы бактерий Bacillus subtilis ТНП - 3 и Bacillus subtilis ТНП - 5 и пробиотик Сахабактисубтил обладают антагонистическим воздействием на микобактерии туберкулеза - подавляют рост и развитие микобактерий. Механизм которого, по нашему мнению заключается в том, что пробиотические штаммы бактерий Bacillus subtilis ТНП - 3 и Bacillus subtilis ТНП – 5 подавляют способность микобактерий образовывать тяжи (корд-фактор), что наглядно установлено при микроскопическом исследовании. Образование тяжей более выражено у микобактерий туберкулеза человеческого вида, по сравнению с микобактериями бычьего вида. Полученные нами результаты экспериментальных исследований согласуются с данными И.Б Павловой, Н.Д. Архиповой [6-8] указывающих, что микобактерии под воздействием различных веществ теряют свои липидные покровы, при этом наблюдается деформация клеток за счет нарушения структуры клеточной стенки, а также с мнением А.Л. Лазовской с соавторами [2,3], А. Шарипова [1] об антагонистической активности пробиотиков в отношении микобактерий.

Далее изучение антагонистического воздействия пробиотика Сахабактисубтил на микобактерии туберкулеза проведено в организме лабораторных белых мышей при экспериментальном заражении возбудителем туберкулеза. Результаты экспериментальных исследований позволили нам заключить, что пробиотик Сахабактисубтил подавляет биологические свойства микобактерий человеческого и бычьего вида, снижает биохимическую активность возбудителей туберкулеза, и тем самым продлевает жизнь подопытных животных по сравнению с контролем.

По результатам исследований получен патент на изобретение «Способ подавления корд-фактора патогенности микобактерий туберкулеза» (RU №2422150).

Выводы. 1. Микобактерии туберкулеза (М. tuberculosis № 492 и М. bovis штамм 14х ВНИИБТЖ), при выращивании на среде Школьниковой образуют корд-фактор на 14-15 день.

2. При микроскопическом исследовании образование корд-фактора более выражено у микобактерий туберкулеза человеческого вида, по сравнению с микобактериями бычьего вида.

3. В результате экспериментальных исследований in vitro и in vivo установлено, что штаммы бактерий Bacillus subtilis ТНП - 3 и Bacillus subtilis ТНП - 5 и пробиотик Сахабактисубтил подавляют биологические свойства М. bovis и М. tuberculosis, который выражается в задержке образования фактора вирулентности – корд фактора.

 

Библиографический список

1. Шарипов,  А. Неспецифические аллергические реакции на туберкулин в Северном Таджикистане: автореф. дис. … канд. ветеринар. наук / А. Шарипов. – Душанбе, 2006. – 21 с.

2.  Действие пробиотиков на патогенные микобактерии / А. Л. Лазовская, З. Г. Воробьева, К. Н. Слинина, М. А. Кульчицкая // Проблемы туберкулеза и болезней легких. – 2007. - № 7. – С. 25-27.

3.  Действие пробиотиков на патогенных микобактерий / А. Л. Лазовская, З. Г. Воробьева, К. Н. Слинина, М. А. Кульчицкая // Вестник ветеринарии. – 2009. - № 1. – С. 28-31.

4. Калмыкова, А. И. Системные эффекты действия пробиотиков: автореф. дис. … докт. биол. наук / А. И. Калмыкова. – Новосибирск, 2006. – 44 с.

5. Неустроев,  М. П. Пробиотики из штаммов Bacillus subtilis. в сельском хозяйстве Якутии / М.П. Неустроев, Н.П. Тарабукина, М.П. Федорова //  Рос.акад.с.-х. наук, Якут.науч.-исслед.ин-т сел.хоз-ва. – Якутск. 2010.– 10 с.

6. Архипова, Н. Д. Выживание популяций Mycobacterium avium и Mycobacterium В-5 в объектах окружающей среды: автореф. дис. … канд. биол. наук / Н. Д. Архипова. – Москва, 2003. – 24 с.

7.  Павлова,  И.  Б.  Атлас морфологии популяций патогенных микобактерий / И. Б. Павлова, Е. М.  Ленченко, Д. А. Банникова. – М.: Колос, 2007. – 180 с.

8.  Архипова,  Н. Д. Изучение антагонистического воздействия Bacillus subtilis ТНП – 5 на популяции клеток микобактерий / Н. Д Архипова, Е. В. Шатрубова // Научное обеспечение сельскохозяйственного производства Республики Алтай. – Новосибирск, 2009. - С. 129-132.