ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ ИЗОЛЯТОВ И ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ БРУЦЕЛЛ.

К.Ж Кушалиев К.Ж., Рахимгалиева С.Ж., Е.Э.Шарипов., А.С. Габдушева ., Р. Зулхарнаева., Б.А. Ажгереев.

Западно-Казахстанский аграрно-технический университет

имени Жангир хана

Целью исследования явилось выделение ДНК методом Полимеразной цепной реакции из изолятов и вакцинных штаммов бруцелл.

Результаты. Проведена работа по сбору образцов изолятов и созданию коллекци и изолятов бруцелл, циркулирующих в регионе Западного Казахстана, собрана база данных о поддерживаемом фонде bruccella bovis. Cистематизированы сведения об источниках выделения и получения коллекционных штаммов bruccell [3, 4].

Выделение ДНК из коллекции изолятов бруцелл. Выделение ДНК проводилось при помощи коммерческого набора Амплисенс «ДНК-сорб-Б», с предварительной подготовкой образцов. Кровь полученная от больных животных предварительно подвергалась серологическому анализу.

Для выделения ДНК использовалась плазма крови больных животных. Качество выделения ДНК определяли при помощи метода электрофореза в агарозном геле, результаты показаны на рисунке 1.

Рисунок 1 – Электрофорез в агарозном геле полученных препаратов ДНК

Выделение ДНК из вакцин штаммов бруцелл 82 и 82-ПЧ. Выделение ДНК из вакцин штаммов бруцелл 82 и 82-ПЧ проводилось при помощи коммерческого набора Амплисенс «ДНК-сорб-Б». Качество выделения ДНК определяли при помощи метода электрофореза в агарозном геле рисунок 2.

Рисунок 2 – Электрофорез в агарозном геле полученных препаратов ДНК из вакцин штаммов бруцелл 82 и 82-ПЧ.

Подбор праймеров и их синтез. Подбор праймеров осуществлялся на основе имеющихся литературных данных по изучению Brucella spp. В результате обработки литературных материалов были подобраны две пары праймеров для видового определения возбудителей заболевания бруцеллеза. На основе компьютерного анализа при помощи пакета программ Vector NTI были проанализированы подобранные две пары праймеров. В результате анализа первая подобранная пара праймеров 24-1 (TGCAGCTCACGGATAATTTG) и 24-2 (ACACCTTGTCCACGCTCAC) строго специфична для B. аbortus. Вторая подобранная пара 25-1(ATCTGGTTCTTTCGGGTGTG) и 25-2 (CATCACCAAGAACCGTGTTG) является маркерной для определения видов B. аbortus, B. melitensis и B. suis рисунок 3. Праймеры были заказаны и синтезированы в компании ЗАО Евроген, Российская Федерация, город Москва

. Рисунок 3 Компьютерная обработка первой пары праймеров для определения B. аbortus.

Таким образом, составлена база данных по изолятам бруцелл циркулирующих в регионе Западного Казахстана и вакцинных штаммов бруцелл 82 и 82-ПЧ.

Оптимизированы условия проведения полимеразной цепной реакции с учетом имеющихся литературных данных по изучению Brucella spp. Оптимизация реакции проводилась по трем направлениям:

1) Температурный профиль;

2) Временной профиль реакции;

3) Состав реакционной смеси;

Разработана программа амплификации коллекции ДНК микроорганизмов рода Brucella, состоящая из 42-х циклов включающая в себя 1 этап «денатурация» при 95 °С в течении 3-х минут, 2 этап «отжиг» при 63 °С в течении 1-ой минуты и 3 этапа «элонгации» или «синтеза» при 72 °С в течении 1-ой минуты.

Состав реакционной смеси включал в себя следующие компоненты: праймеры по 0,1 мкл, буфер для проведения ПЦР реакции по 2,0 мкл, MgCl 1.5 M по 1,2 мкл, смесь дизоксинуклеотидтрифосфатов dNTP в количестве 0,4 мкл и Taq-полимераза по 0,4 мкл на реакцию.