К.б.н. Лахтин М.В., д.м.н. проф. Афанасьев С.С., д.б.н. Лахтин В.М., д.б.н. проф. Алешкин В.А., д.м.н. проф. Афанасьев М.С.*

Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского, Россия; *Первый Московский государственный медицинский университет

имени И.М.Сеченова, Россия

ПЕПТИДНЫЕ ФОРМУЛЫ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ ЖИДКОСТЕЙ МУЛЬТИШТАММОВОГО КОНСОРЦИУМА И ЕГО ИНГРЕДИЕНТНЫХ ШТАММОВ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ

Резюме. Описан алгоритм высокочувствительного сравнительного микроанализа частично гидролизованного белка в культуральных надосадках на примере пробиотических штаммов лактобацилл человека. Рассчитаны ранжированные пептидные формулы Ацилакта, учитывающие ингредиентные штаммы.

Ключевые слова: лактобациллы, бифидобактерии, мультиштаммовый консорциум, культуры, белок.

Resume. Lakhtin M.V., Afanasiev S.S., Lakhtin V.M., Aleshkin A.V., Afanasiev M.S. G.N. Gabrichevsky Research Institute for Epidemiology & Microbiology, Russia; I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Russia. Peptide formulas of cultural fluids of multistrain consortium and its ingredient strains of Gram positive bacteria.

Algorithm of highly sensitive microassay of partially hydrolized proteins in cultures is described on the example of cultures of human probiotic strains of lactobacilli and their multistrain consortium. Peptide formulas of Acilact and ingredient strains are calculated and ranged.

Key words: lactobacilli, bifidobacteria, multistrain consortium, cultures, proteins.

Введение. Культуральные жидкости (КЖ) являются источниками физиологически активного частично гидролизованного белка (ЧГБ). Тестирование ЧГБ различными методами приводит к значительному варьированию результатов. Спектрофотометрические методы анализа являются высокочувствительными и простыми. Цель – оптимизировать спектрофотометрическое определение ЧГБ в КЖ грамположительных бактерий на примере лактобацилл и установить пептидные формулы пробиотического консорциума Ацилакт с учетом его ингредиентных штаммов.

Материалы и методы. Образцы КЖ бактерий, выращенных на среде КД-5с (18-24 ч при 37^оС), получены от Криворучко Е.В. и Черепановой Ю.В. (МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского). Исследовали нативные пробы и варианты С после замораживания (образование верхнего слоя сливок, который удаляли)-оттаивания и/или после пастеризации (кипячение до 30 мин). Пробами служили стерильные надосадки - супернатанты (C) после мембранной микрофильтрации в стакане Steriflip (Millipore), а также их высокомолекулярные концентраты (К) (более 27 кД; получены мембранной ультрафильтрацией С в центрифужных стаканах Centricon Plus-20, Millipore; фактор концентрирования С – 40-60 раз) лактобацилл Lactobacillus helveticus (штаммы NK1 и 100_аш), L. casei K₃III₂₄, пробиотика Ацилакт (NK1+100_аш +K₃III₂₄), ф также бифидобактерий Bifidobacterium longum MC-42. Белок определяли в области поглощения пептидных связей (в мишени необходимы, как минимум, два образующих пептидную связь аминокислотных остатков) по Waddel (1956). Метод разработан для определения сывороточных гликопротеинов: [мкг/мл]= (D₂₁₅ - D₂₂₅) x 144, где D- оптическая плотность, 144- коэффициент, рассчитанный для БСА; сохраняется линейная дозовая зависимость D₂₁₅ или D₂₂₅ в интервале от 0 до 5. Использовали также определение белка по Kalkar (1947) в областях поглощения ароматических аминокислот при 280 и 260 нм: [Trp, Tyr] >> Phe): [мг/мл]= (1.45 х D₂₈₀-0.74 х D_26о. Цветные примеси в КЖ оценивали по D₄₂₀, прямо коррелирующей с визуально слабо выраженной цветностью лактобациллярных С. В контролях использовали растворы бычьего сывороточного альбумина (БСА) и IgG человека. Все измерения – в кварцевой кювете с длиной оптического пути 1 см. Образцы хранили порциями в эппендорфах при -35^оС, пробы перед использованием разбавляли в фосфатно-солевом буфере рН 7.4 (ФСБ).

Результаты и их обсуждение. Сравнили метод Waddel с методом Kalkar. При исследовании С и концентратов из С лактобацилл метод (260, 280 нм) давал завышенные результаты по сравнению с методом (215, 225 нм) из-за неспецифического вклада в определение белка цветных примесей (хромофоров). С лактобацилл характеризовались наличием цветных примесей, занижающих уровни белка при относительно низких разведениях С. Показано, что сходимость значений содержания ЧГБ методом (215, 225 нм) с концентрациями БСА и IgG, приготовленными по навеске, значительно повышается в областях больших разведениях белка (1-10 мкг/мл). Это обусловлено диссоциацией полипептидных комплексов и агрегатов в условиях высоких разведений. При таких разведениях вклад цветных примесей в определение ЧГБ практически отсутствовал.

Определение ЧГБ в С КЖ (со сливками или без) до и после термообработки С (кипячение 30 мин) выявило заниженное содержание ЧГБ (сильно варьирует) в случае нативного Ацилакта. Исследовали причину выхода дополнительного белка после пастеризации Ацилакта. Сравнили 4 серии обработок С: 1) “Размороженные С со сливками без термообработки”, 2) “Размороженные С без сливок без термообработки”, 3) “Размороженные С со сливками с термообработкой”, 4) “Размороженные С без сливок с термообработкой”. Содержание ЧГБ составило:

Серия 1: 25.70 мг/мл (4 определения); разброс 35.08 – 25.40 = 9.68 (минимальный). Формула Ацилакта: К3III24 > 100аш > NK1 >> Ацилакт. Серия 2: 23.89 мг/мл (4 определения); разброс 35.08 – 13.31 = 21.77 (максимальный). Формула Ацилакта: К3III24 > Ацилакт > 100аш > NK1. Серия 3: 24.34 мг/мл (4 определения); разброс 33.26 – 21.17 = 12.09. Формула Ацилакта: Ацилакт > K3III24 > NK1, 100аш. Серия 4: 11.19 мг/мл (4 определения); разброс 20.56 – 3.02 = 17.54. Формула Ацилакта: 100аш > NK1 > Ацилакт > K3III24.

Содержание лактобациллярного ЧГБ в С КЖ по трем сериям (№№ 1-3, с близкими значениями ЧГБ) составляло 24.64 мг/мл (12 измерений). Выводы: а) серии 1-3 - без существенных потерь определяемого ЧГБ; б) содержание ЧГБ снижается в ряду серий: № 1 (максимально близка к нативным С; максимальный разброс результатов) > (№ 3 > № 2) [лучшие серии по воспроизводимости результатов] >> № 4 (не подходит для пробоподготовки перед определением ЧГБ); в) уровни ЧГБ в С превосходят содержание БСА-подобных гидрофобных белков в С более чем на порядок (содержание белка в С - до 2 мг/мл по нашим данным дот-блотового анализа).

Рассчитали содержание ЧГБ (мг/мл) в С Ацилакта и его ингредиентных штаммов по сериям 1-3, а также по всем сериям (1-4).

Ацилакт: 1) 16.93, 2) 25.40, 3) 33.26, 4) 9.07; 25.20 (серии 1-3); 21.16 (серии 1-4). NK1: 1) 25.40, 2) 13.31, 3) 21.17, 4) 12.10; 19.96 (серии 1-3); 18.00 (серии 1-4).

100аш: 1) 25.40, 2) 21.77, 3) 21.17, 4) 20.56; 22.78 (серии 1-3); 22.22 (серии 1-4).

К3III24: 1) 35.08, 2) 35.08, 3) 21.77, 4) 3.02; 30.64 (серии 1-3); 23.74 (серии 1-4).

Ранжирование ЧГБ снижалось в рядах: а) по всем сериям: К3III24 > Ацилакт > 100аш > NK1; б) по сериям 1-3: К3III24 > 100аш > Ацилакт > NK1. Таким образом, K3III24 являлся главным вкладчиком ЧГБ в пептидную формулу Ацилакта. Определение ЧГБ с поглощением в области пептидных связей давало устойчивые (воспроизводимые) ранжирования для К3III24, 100аш и NK1 (наблюдалось сближение по этому признаку Ацилакта с NK1 – главным вкладчиком разнообразия лектиновых/адгезиновых систем в мультиштаммовый консорциум). С бифидобактерий характеризовались меньшим содержанием ЧГБ по сравнению с лактобациллами, что отражало более высокие уровни протеолитической активности в случае лактобацилл.

Относительная независимость определения ЧГБ от условий во всех сериях наблюдалась в случае 100аш. Максимальный разброс в сериях наблюдался в случае К3III24 - нестабильного штамма, С которого характеризовались пролонгированием осадкообразования. В случае Ацилакта происходило высвобождение «дополнительного» ЧГБ в результате кипячения С со сливками (выход сливочного белка), а кипячение без сливок резко снижало определяемый ЧГБ. В разбавленных растворах сливки поддерживали мицеллярные структуры в С с экранированными в мицеллах ЧГБ, причем после удаления сливок в разбавленных растворах продолжались разрушение мицелл и выход из них ЧГБ так, что без кипячения С с удаленными сливками достигалось в случае Ацилакта максимальное содержание ЧГБ. Кипячение С без стабилизирующего влияния сливок приводило к значительному снижению уровня ЧГБ, подобно максимально выраженному снижению уровня белка в случае К3III24 (возможно добавление в С К3III24 сливок Ацилакта или другого ингредиентного штамма в качестве стабилизатора при хранении С К3III24). С кипяченого Ацилакта без сливок был наиболее близок по свойствам ЧГБ к С К3III24. Это приводило к нестабильному хранению 4-й серии С Ацилакта, особенно с использованием циклов «замораживание-оттаивание».

Объемы сливок (темного кольца толщиной 1-3 мм в 20 мл замороженного С в стандартной полистироловой пробирке объемом 25 мл) Ацилакта и его штаммов варьировали в интервале 0.35-0.70 мл. Скорость оттаивания сливок надо льдом в процессе размораживания снижалась в ряду: (100аш [лучший эмульсификатор и лучший пенообразователь] > NK1) [фрагмент последовательности совпадает с относительной максимально выраженной цветностью] > Ацилакт > К3III24 (плохо регистрируется). Выраженность темнокоричневого оттенка сливок снижалась в ряду: 100аш > NK1 (отсутствует обесцвечивающая оксидоредуктазная система; является главным вкладчиком высокомолекулярных экзополимерных соединений в Ацилакт) >> Ацилакт (максимальное влияние обесцвечивающей активности оксидоредуктазной системы вне- и внутриклеточной природы; максимальная доступность этой системы) ≥ К3III24. Цветность не коррелировала с выраженностью сливок.

Результаты указывают на то, что сбалансированный мультиштаммовый консорциум (Ацилакт) повышает стабильность ингредиентных штаммов (подобных неустойчивому штамму К3III24 с постоянно идущим осадкообразованием) за счет донорства стабилизаторов другими ингредиентными штаммами.

Содержание ЧГБ (мг/мл; без аминокислот, пептидов и олигопептидов) в К соответствовало фактору концентрирования С и определению содержания БСА-подобных белков в С лактобацилл (1-2 мг/мл по данным дот-блотового анализа) и варьировало в интервалах (в скобках – снижение надосадочного ЧГБ после кипячения разбавлений К в течение 30 мин): NK1: 62.5-69.0 (27.5%), 100аш: 65.5-75.1 (30.6%), К3III24: 75.5-78.6 (15.1%), Ацилакт: 70.5-73.5(8.98%). Cнижение ЧГБ в ряду термообработанных К (К3III24, Ацилакт > 100аш > NK1) или нативных К (К3III24 > Ацилакт, 100аш > NK1) подтверждено результатами дот-блотового определения ЧГБ (К3III24 > Ацилакт > 100аш > NK1). Термообработка снижала ЧГБ в пробах на 10-30%. При этом образующиеся осадки в случае K3III24 были необратимо агрегированы (не растворялись в ФСБ), в отличие от обратимых осадков Ацилакта. Выраженность цвета К была значительно ниже исходных С.

В целом, предлагаемые нами минимальный и дополненные (в скобках) алгоритмы определения ЧГБ в пробе свежеполученного С включают: замораживание пробы и удаление верхнего слоя сливок (вместо замораживания возможно кипячение 15-30 мин для разрушения эмульсионного состояния и инактивации ферментов); размораживание, центрифугирование, стерилизационную микрофильтрацию (возможно получение К ультрафильтрацией), разбавление С (или К) до уровня 1-10 мкг/мл, точное определение ЧГБ по Waddel, перерасчет содержания ЧГБ в С (или перерасчет белка в С по данным для К). Для анализа ЧГБ достаточно 0.1-1 мкл С КЖ.

Заключение. Предложенные алгоритмы микроанализа ЧГБ удобны для лабораторных скрининговых и других сравнительных исследований культур бактерий. Он перспективен в исследовании микрокультур/микропроб, получения пептидных формул мультиштаммовых консорциумов.