К.б.н. Лахтин М.В., д.б.н. Лахтин В.М., д.м.н. проф. Афанасьев С.С.,

к.б.н. Байракова А.Л., Беликова Е.В., д.б.н. проф. Алешкин В.А.,

д.м.н. проф. Афанасьев М.С.*, д.м.н. проф. чл.-корр. РАМН Караулов А.В.*

Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского, Россия; *Первый Московский государственный медицинский университет 

имени И.М.Сеченова, Россия

 ПРОГНОЗИРОВАНИЕ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ ПРОБИОТИКОПОДОБНЫХ БАКТЕРИЙ, ДРОЖЖЕПОДОБНЫХ ГРИБОВ И АНТИБИОТИКОВ В ПОПУЛЯЦИОННОМ БИОТОПЕ

      Резюме. На примере популяционного урогенитального биотопа проведена прогностическая оценка взаимоотношений лактобацилл, кандид и антибиотиков. Выявлены антикандидные штаммы лактобацилл. Установлены лидерные штаммы взаимовлияния между пулами лактобацилл и кандид в отношении биопленкообразования. Дана оценка антибиотикам как регуляторам переупорядочивания видов условно патогенных микробов – дрожжеподобных кандид в дисбалансированном биотопе. Прогностическая оценка позволяет предложить для конкретного популяционного биотопа конкретные пути усиления пробиотикоподобного и ослабления условно патогенного биотопных компартментов, а также выработать адаптивные конкретные антимикробные стратегии, в зависимости от профилактической и/или терапевтической задачи. Ключевые слова: лактобациллы, кандиды, антибиотики, биотоп, урогенитальный тракт.

      Resume. Lakhtin M.V., Lakhtin V.M., Bajrakova A.L., Afanasiev S.S.,

Belikova Ye.V., Aleshkin A.V., Afanasiev M.S.*, Karaulov A.V.*

G.N. Gabrichevsky Research Institute for   Epidemology & Microbiology; *I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Russia. Prognosis of relationships between probiotic-like bacteria, yeast-like fungi and antibiotics in population biotope. On the example of population   urogenital biotope, prognostic evaluation of relationships between Lactobacillus, Candida and antibiotics was developed. Antifungal Lactobacillus strains were revealed. Leader strains of Lactobacillus and Candida which influence mixed biofilm forming were established. Evaluation of antibiotics as regulators of species composition of disbalanced  biotope microbiocenoses is presented. Prognostic evaluation allows to elaborate the ways of further supporting probiotic-like biotope compartment as well as to decrease risk of relatively pathogenic biotope compartment. It is possible to create new antimicrobial strategies depending on prophylaxis and/or therapy goals. Key words: Lactobacillus, Candida, antibiotics, biotope, urogenital tract.

      Введение. Антибиотикорезистентные штаммы кандид - факторы риска, усложняюющего терапию. Присутствие пробиотического компартмента в урогенитальном биотопе (УГБ) препятствует развитию смешанных инфекций. Способность условно патогенных  грибков к биопленкообразованию (БПО) обеспечивает их защиту, консервацию и депонирование с возможностью выхода из пленки и инициирования болезней [1]. Поиск антимикотических штаммов пробиотических бактерий и их сочетаний с определенными наборами антибиотиков может помочь в разработке  противокандидных стратегий и тем самым сделать терапию более предсказуемой [2]. Лактобациллы и кандиды представляют собой высокочувствительную (сенсорную) выраженную в биотопах динамичную систему противопоставленных функционально различных компартментов в УГБ популяции населения [3, 4]. Цель – разработать комплексный подход к оценке и прогнозированию взаимоотношений лактобацилл, кандид и антибиотиков в популяционном УГБ.

      Материалы и методы. Штаммы микроорганизмов изолированы из УГБ пациентов городской популяции, проходивших медицинский осмотр в клинико-диагностическом центре при МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского. Исследовали идентифицированные штаммы лактобацилл L. acidophilus 106, 124, 183a; L. casei 124б, 183; L. brevis 104, 109, 143; кандид (в скобках – резистентность к антибиотикам, обозначения смотри ниже) С. albicans 3 (Амф), 23 (Ит, Фл), 26 (Амф), 45 (Амф), 116, 147, 161, 320 (Амф); C. krusei 5 (Амф, Ит), 60 (Амф, Ит), 125 (Амф, Ит), 135 (Амф), 185 (Амф, Ит, Кло), 309 (Амф, Ит, Ке, Фл); C. tropicalis 97, 112, 144, 162, 417 (Амф, Кло, Фл), 433, 438, 897 (Амф, Кл, Фл). Исходные суспензии микроорганизмов в физрастворе с мутностью 1 единица (по шкале МакФарланда [McFarland]) смешивали попарно (лактобациллы + кандиды) в среде MRS в лунках полистироловой микропанели в оптимизированном соотношении (40 + 40 + 170 = 250 мкл) и инкубировали 2 суток при 37оС. БПО фотографировали и сканировали, а пленки обрабатывали виолетовым красителем, который затем экстрагировали раствором уксусной кислоты [5]. Экстракты переносили в новые микропанели и измеряли поглощение при 620 нм. Антибиотикозависимость исследовали с использованием стандартных дисков с антимикотиками - амфотерицином (Амф), итраконазолом (Ит), кетоконазолом (Ке), клотримазолом (Кло), нистатином (Ни), флюконазолом (Фл); другими антибиотиками – Азитромицином (Аз), Амоксициллином (Амо), Гентамицином (Ге), Доксициклином (До), Кларитромицином (Кла), Клиндамицином (Кли), Цефалексином (Це) и Ципрофлоксацином (Ци). Особенности метаболизма штаммов лактобацилл исследовали с помощью стриповой микропанели ANAEROtest 23 (MIKRO-LA-TEST, PLIVA-Lachema). Все результаты усреднены не менее чем по трем измерениям.

      Результаты и их обсуждение. 1. Типированы штаммы лактобацилл по способности к БПО. Типы I-III включали (БПО в % от максимального поглощения экстракта из пленки тестированных лактобацилл; *достоверные отличия [P < 0.05] от штамма 124 и между штаммами 143 и 109): I (75-100%, повышенное БПО) - шт. 183 [0.286*±0.031(22); 100%], шт. 143 [0.236* ±0.069(22); 83%]; II (25-75%, умеренное БПО) - шт. 183a [0.139*±0.015(22); 49%], шт. 109 [0.102* ±0.014(22); 36%], шт. 106 [0.100*± 0.012(22); 35%], шт. 104 [0.084* ±0.005(22); 29%]; III (0-25%, слабое и отсутствующее БПО) - шт. 124б [0.068* ± 0.005(22); 24%], шт. 124 [0.058±0.006(22); 20%]. Лактобациллы типов I и II могут служить источниками поверхностно клеточных лектинов, а III – секретированных в среду лектинов. 2. Штаммы L. acidophilus 106 и

L. brevis 104 снижали БПО  мультиантибиотико-резистентными штаммами

C. krusei 185 (также действовали штаммы L. acidophilus 124 и L. brevis 143) и

C. tropicalis 897. В целом, выявленные антимикотические штаммы лактобацилл обладали повышенным ингибирующим БПО кандид действием в отношении штаммов C. albicans и C. tropicalis (ингибирование 60-80%) по сравнению со штаммами C. krusei (ингибирование 40-60%). 3. Ранжировано снижение способности  БПО штаммами лактобацилл: а) монокультурами: 183 > 143 > 183a > 106, 109 >  104 > 124б > 124; б) в составе смешанных культур (влияние на каждый штамм лактобацилл всех штаммов кандид): 124б > 124 > 183 > 143 > 183a > 106 > 109 > 104. Штаммы L. acidophilus 124 и L. casei 124б (относятся к типу III)  – лидерные: их удаление приводит к идентичности обеих указанных выше последовательностей. Оба эти штамма влияют на метаболизм кандид (сцеплены с их метаболизмом), обладают потенциальным пробиотическим действием. 4. Способность к БПО наиболее сильно варьировала у штаммов

C. albicans (в меньшей степени - у штаммов C. tropicalis).  Ранжировано снижение способности  БПО штаммами кандид: а) монокультурами: 438 > 23 > 144 > 116 > 135 > 5 > 897 > 97 > 147 > 309 > 3 > 162 > 26 > 320; б) в составе смешанных культур (влияние на каждый штамм кандид всех штаммов лактобацилл): 23 > 309 > 320 > 147> 144 > 135 > 97 > 5 > 438 > 897 > 162, 116 > 3, 26. Совокупность штаммов лактобацилл более всего влияла (достигался максимальный разброс позиций в последовательностях «а» и «б») на антибиотикорезистентные штаммы C. albicans 320 и, в меньшей степени,

C. krusei 309. Можно прогнозировать, что в смешанной с этими штаммами биопленке лактобациллы сильно выражены, что значительно снижает  патогенный потенциал биопленки. 5. Исследована антибиотикозависимость лактобацилл. На фоне общей повышенной чувствительности лактобацилл к Аз, Ам, Ге, До, Кла, Кли, Це и Ци наблюдалась сниженная чувствительность лактобацилл к Аз (штаммы 106 и 124), Ге (штаммы 104, 106, 124, 183а) и Кли (штаммы 104, 106, 124, 183а). Сравнительная устойчивость штаммов к антибиотикам: 106 и 124 - Кла/Кли > Ге, 183а – Кли > Ге, устойчивость к Кли – L. acidophilus > L. brevis. Таким образом, при использовании Аз, Кли и/или Ге при терапии можно ожидать в условиях УГБ дополнительного антимикробного действия исследованных штаммов лактобацилл преимущественно вида

L. acidophilus (уже имеющихся в УГБ или привнесенных туда извне, например, в составе потенциального пробиотического консорциума). При этом могут быть снижены терапевтические дозы антибиотиков. 6. Исследована антибиотико-зависимость кандид. Кандиды УГБ характеризовались снижением чувствительности к каждому типу антимикотика  в ряду (в скобках – число резистентных к данному антимикотику штаммов): Ни (0) > Ке (1) > Кло (3) >Фл (4) > Ит (6) > Амф (12). Амф проявлял свойства универсального маркера резистентности исследованного пула рода кандид, а Ни – универсального маркера чувствительности пула кандид. Чувствительность видов кандид к Кло снижалась в последовательности C. albicans > C. krusei > C. tropicalis. Кло проявлял свойства внутриродового межвидового переключателя в пределах функциональной группы «C. albicans + C. tropicalis». Выявлены последовательности видовой чувствительности кандид к антимикотикам (в скобках – диаметры зон без роста, мм): C. albicans (8 штаммов): Ке (21.4) >> Кло (16.9) ≥ Фл (16), Ни (16) >> Ит (12.0) >> Амф (6.5); C. krusei (6 штаммов):  Ни (18.0) >> Ке (14.3) > Фл (12.0), Кло (11.7) >> Ит (2.0) >> Амф (0); C. tropicalis (8 штаммов): Ке (23.8) >> Ни (19.0) >> Фл (14.3) > Ит (12.8) > Амф (11.3) > Кло (10.0). Во всех указанных видовых последовательностях присутствовала характерная для рода (надвидового пула кандид УГБ) последовательность Ке > Фл > Ит > Амф. Таким образом, Ни и Кло проявляли свойства лидерных (сцепленных с метаболизмом кандид) антибиотиков (максимально варьирующих в видовых последовательностях популяционного УГБ). Результаты демонстрируют возможности исследования новых аспектов антибиотиков как переключателей внутримикробиоценозных таксонов популяционных УГБ, регуляторных упорядочивателей микробиоценозов в организме, сменщиков сбалансированности УГБ. 6. Метаболическая видоспецифичная активность лактобацилл снижалась в ряду (в скобках – утилизируемые углеводы и другие индикаторные реагенты): L. brevis [галактоза, манноза, лактоза, раффиноза, эскулин] > L. casei [сахароза, мальтоза, эскулин] > L. acidophilus [раффиноза, эскулин]. Таким образом, выявленные нами лидерные штаммы L. acidophilus 124 и L. casei 124б (тип III БПО), сцепленные с метаболизмом кандид (относительно зависимые от метаболизма кандид, приспособленные к сосуществованию в условиях совместной близкой локализации с ними, вплоть до совместного БПО), характеризуются менее выраженным разнообразием ферментов углеводного обмена на фоне присутствия более выраженных протеолитических и оксидоредуктазных систем (показано нами) по сравнению с L. brevis. С другой стороны, аналогичная видоспецифичная метаболическая активность кандид снижается в ряду: C. tropicalis [мальтоза, ксилоза, сахароза, трегалоза, целлобиоза] > С. albicans [мальтоза, ксилоза, сахароза] > C. krusei [уреаза: КФ 3.5.1.5.]. У кандид и лактобацилл при наличии одинаковых (конкурентных)  субстратов имеются возможности переключения на альтернативные (особенно в условиях разнообразия ди- и олигосахаридных мишеней). Функциональная группа «C. tropicalis + С. albicans» сорентирована на углеводы, в отличие от кандид C. krusei, сориентированных на фермент не углеводного обмена с щелочным оптимумом рН. Таким образом, исследованная нами модельная система противопоставленных и кофункционирующих видов является метаболически взаимодополняемой, охватывающей достаточно широкую метаболическую сеть биотопа, заметно влияющую на биотопный баланс. Способность антибиотиков (например, Кло) к «облегченному» межвидовому переключению (например, в группе «C. tropicalis + С. albicans»), по-видимому, обусловлена в том числе вкладом локально возникающего устойчивого дисбаланса между близкими видами в борьбе за сходные субстраты. При этом метаболиты лактобацилл (ингибиторы гидролаз, лектины, прочие антигрибковые вещества) создают дополнительный прессинг на кандиды этой группы, усиливая видовой дисбаланс и действие лидерных антибиотиков.

      Выводы. 1. Выявлены новые антимикотические штаммы лактобацилл  видов L. brevis, L. casei и L. acidophilus, супрессирующие БПО антибиотикорезистентных штаммов кандид C. albicans, C. tropicalis и C. krusei. Наиболее перспективными из них являются штаммы с относительно сниженной антибиотикочувствительностью (L. acidophilus 106, 124 и 183а; L. brevis 104). Перспективно взаимодополняющее комбинированное использование антимикотических штаммов в составе потенциальных консорциумов, подобно пробиотику Ацилакт. 2. Предложены новые антимикробные стратегии использования антибиотиков (как регуляторов переупорядочивания микробных таксонов в дисбалансированном биотопе), антибиотиков и лактобацилл (перераспределение таксономических мишеней между антимикотиками и лидерными штаммами лактобацилл) в профилактике, лечении болезней (главных и сопутствующих), достижения полной реабилитации (в том числе при антибиотико- и химиотерапии, постхирургической). 3. Полученные данные обозначивают дальнейшие перспективы прогнозирования состояний популяционного биотопа в рамках развития научного направления - популяционная медицинская микробиология/ биотехнология/ эпидемиология.   

      Литература

      1. Lakhtin V.M., Lakhtin M.V., Bajrakova A.L., Afanasiev S.S. Candida albicans: New aspects of pathogenicity, interaction to antifungals, biofilms and preventive anti-Candida strategies - The overview of own works // In the Book: ''Candida albicans: Symptoms, Causes and Treatment Options''. Eds L.A. Dietrich and T.S. Friedmann. New York: Nova Science Publishers, 2013. - P. 145 - 152. ISBN: 978-1-62808-882-3.

      2. Лахтин М.В., Афанасьев С.С., Лахтин В.М., Байракова А.Л., Алешкин А.В., Алешкин В.А. Новые подходы к прогностике и диагностике биотопных микозов // Успехи медицинской микологии. - Т. 11. - М.: Национальная академия микологии, 2013. - С. 28-29.

      3. Лахтин М.В., Байракова А.Л., Лахтин В.М., Алешкин А.В., Афанасьев С.С.,  Алешкин В.А. Кофункционирование лектинов мультикомпонентного пробиотика и потенциального пробиотического компартмента биотопа на примере ауторегуляторной лактобациллярной системы // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2012. - № 5 (87); Часть 1. - С. 250 – 253.

      4. Лахтин М.В., Байракова А.Л., Лахтин В.М., Афанасьев С.С. Алгоритм упорядочения рядов смешанных микроорганизмов одного и того же биотопа человека, в зависимости от пленкообразования, для выявления регулирующих смешанные биопленки штаммов Candida tropicalis и Lactobacillus // Клин. лаб. диагн. - 2013. - № 9. - C. 75 - 76.

      5. Лахтин В.М., Байракова А.Л., Лахтин М.В., Афанасьев С.С., Алешкин А.В., Алешкин В.А. Паттерновый алгоритм ранжирования штаммов взаимодействующих микробиоценозов нормофлоры биотопов человека в микрокультурах в условиях присутствия ассоциатов, роста и образования биопленок в полистироловых микропанелях: выявление лидерных штаммов-коммуникаторов, регулирующих и упорядочивающих микробиоценозы // Диагностика и профилактика инфекционных болезней: материалы НПК (26-28 сентября 2013, Новосибирск). Новосибирск: Издательство «Ареал», 2013.- С.14.