Биологические науки/6 Микробиология

 

К.б.н. Гордонова И.К., д.б.н. Никитина З.К.

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР), Москва, Россия

Изучение влияния факторов экзогенной регуляции на биосинтетическую активность и адаптационные свойства микромицета Penicillium citrinum, секретирующего кератиназу

 

     Кератиназы являются перспективными препаратами и применяются в различных областях, где необходим гидролиз кератинов: для конверсии кератинсодержащих отходов, в производстве кормовых гидролизатов, в кожевенной и текстильной промышленности, для очистки сточных вод. Кроме того, ферменты могут применяться в биомедицинской, фармацевтической и косметической индустрии для гидролиза прионов, приготовления вакцин при лечении дерматофитозов, производства биоактивных пептидов, удаления кератина при лечении псориаза и акне, деградации кератинизированной кожи и депиляции. Ранее нами было показано, что Penicillium citrinum РС-54-91ВИЛАР, как и некоторые другие изученные дейтеромицеты, секретирует в культуральную жидкость ферменты, расщепляющие α–кератин волос [1, 2]. Разработан способ выделения высокоочищенного ферментного препарата кератиназы указанного микромицета и дана характеристика её свойств [3]. Однако продуктивность микроорганизма была не достаточно высокой даже при длительном времени культивирования, что ограничивало возможность практического применения данного штамма. Целью работы являлась оптимизация способа получения кератиназы P. citrinum РС-54-91ВИЛАР путем направленной адаптации культуры и экзогенной регуляции биосинтеза фермента.

     Штамм Penicillium citrnum РС-54-91ВИЛАР культивировали на скошенной поверхности агаризованной среды Чапека в течение 7-ми суток в термостате при 260С. Для направленной адаптации дейтеромицета выращенную культуру пересевали несколько раз на агаризованную среду Чапека с заменой сахарозы на кератин волос. Культивирование в глубинных условиях осуществляли на модифицированной среде Чапека с частичной заменой сахарозы на кератин волос. Количество посевного материала при глубинном культивировании составляло от 5x107 – 6x108 спор на 100 мл среды. В фильтратах культуральной жидкости проводили определение кератиназной активности модифицированным методом Anbu et al [4]. Удельную кератиназую активность рассчитывали в пересчете на мг внеклеточного белка, определенному методом Лоури.

     На первом этапе настоящей работы была исследована зависимость кератиназной активности Penicillium citrinum от количества пересевов на модифицированной среде, содержащей кератин. Установлено, что еще до проведения пассирования культуры на модифицированной среде ее глубинное культивирование в присутствии кератина приводило к синтезу кератиназы и ее секреции в культуральную жидкость. При возрастании числа пересевов на агаризованной среде с кератином от 1 до 3 происходило снижение времени культивирования с 10 до 6 суток, а также увеличение накопления фермента в 2,4 раза. Увеличение количества пассажей не вызывало дальнейшей адаптации Penicillium citrinum.

     Показано, что изменение количества засеваемых спор в интервале 5x107 – 6x108 cпор на 100 мл питательной среды не приводило к статистически достоверным изменениям максимальной суммарной кератинолитической активности культуральной жидкости. При отсутствии кератина в среде даже при длительном времени культивирования (до 14 суток) кератиназная активность не обнаруживалась, что свидетельствует об индуцибельном синтезе фермента. Изменение соотношения сахароза : кератин от 1:19 до 1:3 приводило к увеличению максимальной суммарной кератиназной активности в 1,6 раза при сокращении времени культивирования до ее достижения с 8 до 6 суток. Дальнейшее повышение концентрации сахарозы до соотношения 1:1 и 3:1 вызывало постепенное понижение кератиназной активности в 1,1 и 3,1 раза и повышение времени культивировании до 8 и 10 суток соответственно. На основании полученных результатов на данном этапе работы была выбрана питательная среда, содержащая 0,5% сахарозы и 1,5% кератина, при культивировании на которой на 6 сутки кератиназная активность составляла 2,6 КЕ/мл.

     Поскольку различные виды кератиновых субстратов могут быть гидролизованы в зависимости от вида микроорганизма только на 5 – 50%, а используемый в данном исследовании кератиновый субстрат (волосы человека) наиболее трудно поддаются протеолизу, целесообразным представлялось изучение влияния концентрации кератина в среде на накопление кератиназы. При увеличении концентрации субстрата от 1,5 до 10% наблюдалось увеличение максимальной кератиназной активности на 141% при том же времени культивирования. Дальнейшее увеличение кератина волос в среде не приводило к статистически достоверному изменению ферментативной активности.

     Для выделения и очистки кератиназы из фильтрата культуральной жидкости последовательно применяли гель-фильтрацию и аффинную хроматографию. Фракция, соответствующая внешнему объему колонки и материалу с молекулярной массой выше 15 кДа, полученная после проведения гель-фильтрации, обладала значительной кератиназной активностью, превышающей удельную кератиназную активность исходного препарата в 3,03 раза, и составляла 11,8 КЕ/мг. После проведения аффинной хроматографии ферментативная активность полученного препарата возрастала до 231,1 КЕ/мг, то есть увеличивалась в 59,3 раза.

Таким образом, проведенные исследования позволили увеличить продукцию кератиназы культурой Penicillium citrinum PС-54-91ВИЛАР в 5,8 раза, сократить время культивирования с 10 до 6 суток по сравнению с неадаптированным штаммом и получить в двухстадийном хроматографическом процессе препарат кератиназы, расщепляющий α–кератин волос, с продуктивностью 18 мг/л культуральной жидкости и активностью 231 КЕ/мг, выходом 70% и степенью очистки 59,3 раза.

Выводы

1.При 3-кратном пересеве Penicillium citrinum на модифицированной агаризованной среде с кератином удалось снизить время культивирования с 10 до 6 суток, а также увеличить накопление фермента 2,4 раза.

2.Установлена оптимальная концентрация сахарозы в среде, обеспечивающая рост микроорганизма и синтез кератиназы в присутствии кератина.

3.При увеличении концентрации субстрата от 1,5 до 10% наблюдалось увеличение максимальной кератиназной активности на 141% при том же времени культивирования.

4.Проведенные исследования позволили увеличить выход фермента в 5,8 раза.

 

Литература:

1. Гордонова И.К., Дмитриев Г.В., Никитина З.К. Поиск микроорганизмов – продуцентов кератиназ. // Вопр. биол., мед. и фарм. химии. 2007. № 4. С. 11-15.

2. Гордонова И.К., Никитина З.К., Зон Х.Ч., Томашевич С.В., Быков В.А. Изучение протеолитических свойств дейтеромицетов при росте на модифицированных и немодифицированных кератинсодержащих субстратах. // Вопр. биол., медиц. и фармацевтич. химии. 2009. №1. С. 19-24.

3. Никитина З.К., Гордонова И.К. Выделение, очистка и биохимические свойства кератинолитического фермента, секретируемого Penicillium citrinum. Вопр. биол., мед. и фарм.химии. 2013, №1, С. 36-41.

4. Anbu P, Gopinath S.C.B., Hilda A., Mathivanan N., Annadurai G. Secretion of keratinolytic enzymes and keratinolysis by Scopulariopsis brevicaulis and Trichophyton mentagrophytes: regresson analysis. // Can. J. Microbiol . 2006. V.52. P. 1060-1069.