Химия и химические технологии

4. Химико-фармацевтическое производство

Мальгина Д.Ю.^*, д.м.н. Волкова Л.В.^**

^* ГБОУ ВПО Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава Российской Федерации;

^** ГБОУ ВПО Пермский национальный исследовательский

политехнический университет

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГЕМОДЕРИВАТА ПРИ КОНТРОЛЕ

КАЧЕСТВА ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ЛЕЙКОЦИТАРНОГО

ИНТЕРФЕРОНА

Разработана технология гемодеривата из эритромассы крови человека. Определены основные физико-химические свойства гемодеривата, а так же его биологическая активность. Разработан состав питательной среды, содержащей гемодериват. Проведена серия испытаний пролиферативной активности экспериментальной среды с гемодериватом с использованием перевиваемой культуры эпителиальной ткани почки эмбриона свиньи (SPEV) . Выявлено, что скорость роста культуры клеток и формирование монослоя характеризовались более высокими показателями по сравнению с контрольной – средой 199. Обоснована возможность использования среды с гемодериватом для культивирования SPEV.

Ключевые слова: эритромасса, лейкоцитарный интерферон, SPEV

Введение.

Производные крови человека – гемодериваты как биологически активные субстраты, содержащие в своем составе низкомолекулярные соединения – пептиды и аминокислоты – могут быть использованы в качестве компонентов в питательных средах для выращивания клеточных линий, бактерий, бактериофагов и т.д. [1]. Источниками для выделения гемодериватов может служить как цельная кровь, так и ее дифференцированные клеточные фракции. В нашей работе в качестве источника использовали эритромассу – побочный продукт технологии человеческого лейкоцитарного интерферона (ЧЛИ), образующийся на стадии выделения лейкомассы из лейкоэритромассы.

Одним из предприятий, выпускающих ЧЛИ, является филиал ФГУП НПО «Микроген» в Перми, при производстве которого эритромассы образуется большое количество. Эритромасса крови человека – белковый субстрат, не полноценный по одной аминокислоте – изолейцину, и состоящий до 95% из белка гемоглобина [2]. Побочный продукт технологии ЧЛИ кроме эритромассы содержит некоторое количество полноценных белков плазмы крови (различные глобулины, альбумин). Присутствие последних компенсирует недостаток изолейцина в эритромассе. Наличие ценных белковых компонентов в побочном продукте технологии ЧЛИ позволило рассматривать его как белковый субстрат полноценного аминокислотного состава, при гидролизе которого можно получать продукт, сохраняющий все аминокислоты исходных белков, определяющих состав и биологическую значимость гидролизата. Продукт с такой характеристикой может обладать высокой питательной ценностью в отношении биологических объектов, например, микроорганизмов или культур тканей. Необходимо отметить, что для контроля специфической активности ЧЛИ используют перевиваемую культуру эпителиальной ткани почки эмбриона свиньи (SPEV), для культивирования которой применяют среды Игла, 199 и др. [5]. Разработана технология гемодеривата из побочного продукта технологии ЧЛИ – эритромассы, оценены его физико-химические параметры, а так же биологическая активность. Для подтверждения последней предпринята попытка модификации состава питательной среды для культивирования клеточной линии SPEV путем внесения в ее состав гемодеривата.

Цель исследования – разработка состава и оценка биологической активности питательной среды, содержащей гемодериват, для культивирования клеточной линии SPEV, используемой при контроле специфической активности ЧЛИ.

Материалы и методы.

В работе использован гемодериват, полученный по оригинальной технологии из эритромассы крови человека. Состав гемодеривата контролировали по основным физико-химическим параметрам: рН ионометрическим способом, концентрация хлоридов методом окисления марганцевокислым калием в кислом растворе, содержание аминного азота методом формольного титрования [3].

Гемодериват применяли в составе питательной среды для культивирования перевиваемой клеточной линии SPEV, содержащей основу – среду 199 и активный ингредиент – раствор гемодеривата с концентрацией сухих веществ 20 мг/мл в количестве 15% от общего объема среды. Эффективность питательной среды определяли по индексу пролиферации (ИП) клеточной линии SPEV, выращиваемой при температуре (37±1) °С в течение 5 последовательных пассажей. Индекс пролиферации – величина, показывающая во сколько раз больше клеток наросло, чем было засеяно. Нагрузка клеток на каждом пассаже составляла не менее 30 тыс/мл. Для подсчета клеток использовали камеру Горяева и микроскоп с увеличением 100 раз. Клетки пересевали на вторые сутки после образования монослоя.

Основные результаты.

Определены физико-химические показатели гемодеривата (раствор 20 мг/мл по сухому веществу), а так же дана сравнительная оценка с составом среды 199. Результаты представлены в табл. 1 (n=5, P=0,95).

Таблица 1

Сравнительная оценка физико-химических параметров гемодеривата из эритромассы крови человека и 199 среды.

№	Параметр	Значение (М±m)
		Р-р гемодеривата	199 среда
1	рН	3,55±0,15	7,00±0,20
2	Хлориды, мг/мл	3,30±0,20	5,20±0,50
3	Аминный азот, мг/мл	1,60±0,20	Не менее 0,13

Низкое значение рН гемодеривата связано с тем, что для гидролиза эритромассы применяли пепсин, максимум протеолитической активности которого лежит проявляется при значении рН от 1,5 до 2,0, для достижения которого использовали 0,1М соляную кислоту. Концентрация аминного азота в растворе гемодеривата в 12 раз превосходила минимально допустимое значение в 199 среде [4]. Содержание аминного азота как источника легкоусваиваемых аминокислот явилось определяющим фактором при конструировании питательной среды с гемодериватом.

Проведена оценка биологической активности экспериментальной питательной среды на основе гемодеривата (рис. 1; n=5, P=0,95).

Таблица 2

Исследование стабильности пролиферативных свойств

экспериментальной питательной среды, содержащей гемодериват,

в зависимости от срока его хранения в сухом виде

Срок хранения лиофилизированного гемодеривата, мес.		Значение ИП, у.е.
		1П	2П	3П	4П	5П
0	Среда с гемодериватом	7,4±0,4	8,0±0,2	8,5±0,5	8,6±0,4	8,7±0,5
4		7,7±0,3	7,5±0,2	8,8±0,3	8,5±0,4	8,3±0,4^*
12		6,8±0,3	7,6±0,4	7,6±0,4	7,9±0,2	7,5±0,4^**
	Контроль среда 199	6,4±0,4	5,9±0,3	6,8±0,2	6,8±0,2	6,9±0,1^***

Примечание: * - р>0,05; **- р<0,05 (относительно значения ИП при нулевом сроке хранения); ***- р<0,05 (относительно значения ИП при сроке хранения 12 мес.) по t-критерию Стьюдента.

Индексы пролиферации клеток SPEV не имели тенденции изменяться при культивировании на экспериментальной среде, содержащей гемодериват со сроком хранения до 4 месяцев. Статистически значимое отклонение значений индексов пролиферации выявлено только при сравнении данных, полученных при использовании среды со сроком хранения 12 и 0 мес – ИП имели тенденцию снижаться. При этом существовало статистически значимое различие между значениями ИП на среде, содержащей гемодериват со сроком хранения 12 мес., и контрольной: ИП на первой среде были выше, чем на второй.

Культивирование клеточных линий с целью быстрого наращивания биомассы целесообразно проводить на средах, содержащих гемодериват с любым из исследованных сроком хранения. В производственных условиях среду, содержащую гемодериват, можно рекомендовать для выращивания и поддержания клеточной линии SPEV, поскольку значения ИП на ней выше, чем на контрольной. В связи с этим эффективность использования среды с гемодериватом будет обоснованной до тех пор, пока значения индексов пролиферации клеточной линии на ней будут выше, чем на контрольной среде. Соответственно, допустимо использование питательных сред, содержащих гемодериват со сроком хранения до 12 мес.

Далее проведено испытание, показывающее возможность промышленного использования клеточной линии SPEV, полученной на питательной среде, содержащей гемодериват. Клеточную линию SPEV выращивали на экспериментальной и контрольной питательных средах. Полученную клеточную линию использовали в процессе оценки специфической активности интерферона. Выявлено, что результаты определения противовирусной активности интерферона с применением клеточной линии, полученной на экспериментальной и контрольной питательных средах не имеют статистически значимых различий. Таким образом, вариант питательной среды, содержащей гемодериват, можно рекомендовать для применения в технологии человеческого лейкоцитарного интерферона, а именно на стадии контроля противовирусной активности препарата.

Заключение.

Описана возможность получения функционального продукта из отхода технологии ЧЛИ – эритромассы. Оценена биологическая эффективность гемодеривата при выращивании клеточной линии SPEV на экспериментальной питательной среде: значения ИП и скорость роста культуры были выше, чем на контрольной среде. Последний факт явился приоритетным, так как сокращение срока культивирования ведет к оптимизации технологического процесса по времени, поскольку клеточная линия SPEV применяется на стадии оценки противовирусной активности ЧЛИ. Использование побочного продукта производства ЧЛИ способствует снижению себестоимости выпускаемого препарата, поскольку в его технологии будет предусмотрено использование побочных, но в биологическом смысле ценных, продуктов.

Литература:

1. Ворошилова, Н. Н. Научные основы и разработка технологий производства препаратов бактериофагов Shigella и Klebsiella : автореф. дис. д-ра мед. наук / Н.Н. Ворошилова. – Москва, 1992. – 53 с.

2. Бузмакова, Д. Ю. Применение протеолиза для биотрансформации белков / Д. Ю. Бузмакова, А. В. Казьянин, Л. В. Волкова // Вестник уральской медицинской академической науки : темат. выпуск по микробиологии, иммунологии и биотехнологии. – Екатеринбург, 2011. – №4/1. – С. 190-191.

3. Методы контроля бактериологических питательных сред. Методические указания : МУК 4.2.2316-08. – Роспотребнадзор, 2008. – 55 с.

4. Производство питательной среды 199 жидкой. Промышленный регламент. – Пермь, 1994. – № 483-94.

5. Фрешни, Р. Я. Культура животных клеток: практическое руководство / Р. Я. Фрешни. – пер. 5-го англ. изд. – Москва : БИНОМ, лаборатория знаний, 2010. – 691 с. – ил. – [С. 149-163].

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.