УДК 616.36-092.9:576.32/.36]:54.31

вплив олігоефірів на стан мікросомальної монооксигеназної системи гепатоцитів білих щурів в експерименті

Багмут І.Ю.

Харківська медична академія післядипломної освіти, Харків

Вивчено вплив олігоефірів на стан мікросомальної монооксигеназної системи гепатоцитів білих щурів в умовах підгострого експерименту. Визначено, що олігоефіри в 1/100 ДЛ₅₀ активують всі параметри мікросомальної монооксигеназної системи. Отримані результати свідчать про можливу патогенетичну роль монооксигеназної системи гепатоцитів у розвитку вільнорадикальної патології і активації перекисного окислення ліпідів.

Ключові слова: олігоефіри, мікросомальна монооксигеназна система, мембрано-структуровані ферменти, тварини, щури популяції Вістар.

Вступ. Із сучасних медико-біологічних позицій за умов впливу на організм факторів оточуючого та виробничого середовища, для оцінки резервних можливостей, ступеню стійкості до несприятливої дії, найбільш адекватні методи вивчення модифікуючої дії хімічного забруднення на рівні мікросомальної оксидазної системи з паралельним дослідженням можливого несприятливого ефекту на рівні мембрано-структурованих ферментів [1].

Вивчення стану мікросомального окислення має велике значення у розкритті молекулярних механізмів біологічної дії, біотрансформації, токсикодинаміки чужорідних для організму хімічних сполук.

Метою дослідження було вивчення впливу олігоефірів у підгострому токсикологічному досліді на активність монооксигеназного і редуктазного електронно-транспортного ланцюгу мікросом гепатоцитів в умовах перорального надходження їх до організму щурів.

Об’єкти та методи дослідження. Експериментальна частина роботи виконана на 70 статевозрілих щурах популяції Вістар, які впродовж 40 діб були підвернені пероральному впливу поліетиленоксидів у дозах 1/10, 1/100 ДЛ₅₀. Контрольну групу склали 10 статевозрілих щурів популяції Вістар. Найбільш значимі розбіжності з контролем були під впливом дози 1/10 ДЛ₅₀, тому у роботі надані результати експерименту під впливом олігоефірів саме у цій дозі. В якості об’єктів дослідження були використані олігоефіри молекулярної маси М.м. 200, 1100, 3000, та 4000, які мали відповідно товарну назву олігоефіри марки: Л-202, Л-1102-4-80, Л-3003-2-60, Л-4003-2-20 з регламентованими фізико-хімічними властивостями. Ці речовини мають широке використання у різних галузях народного господарства для отримання поліуретанів, емалей, лаків, пінопластів, епоксидних смол, штучної шкіри, гальмівних, гідравлічних та охолоджуючих рідин. На основі параметрів токсичності, відносяться до помірно та малотоксичних сполук (3-4 клас небезпечності), які не володіють кумулятивними та шкірянорезорбтивними властивостями.

Стан мікросомального окислення оцінювався за дихальною та ферментативною активністю, вмісту цитохромів b₅ і P₄₅₀. В цьому зв’язку мембрани ендоплазматичного ретикулуму виділяли за методом S.A. Komoth, K.A. Narayan [2].

Вміст білку у суспензії мікросом визначали модифікованим методом Лоурі [3].

Споживання кисню суспензією мікросом реєстрували за допомогою закритого платинового кисневого електроду Кларку [4] на полярографі «ПА-3» (ВНР).

НАДФ·Н-цитохром C-редуктазну та НАД·Н-цитохром C-редуктазну активності реєстрували на двопроменевому спектрофотометрі «Specord UV VIS» (ГДР) при довжині хвилі 550 нм за методом L. Ernster et al. [5].

Визначення вмісту цитохромів b₅ і P₄₅₀ проводили у суспензії мікросом за методом T. Omura, R. Sato [6].

Вимірювання вмісту цитохрому b₅ основувалося на визначенні різниці у поглиненні окисленої та відновленої форм гемопротеїну, а цитохрому P₄₅₀ – на вимірюванні величини поглинення комплексу відновленого цитохрому P₄₅₀ з окисом вуглецю. Визначення цитохромів здійснювалося за допомогою реєструючого спектрофотометру СФ-46. Для оцінки швидкості реакції окислювального деметилювання, суспензію мікросом додавали у середовище інкубації, ініціюючи її внесенням НАДФ·Н. Зупиняли реакцію трихлороцтовою кислотою (ТХО), обробляли лугами, осаджували білок центрифугуванням та визначали р-нітрофенол на спектрофотометрі СФ-46 при довжині хвилі 436 нм [3].

Статистична обробка отриманих результатів проведена за допомогою критерію Ст`юдента-Фішера.

Результати дослідження та їх обговорення. В біотрансформації ксенобіотиків приймає участь багато органів та тканин: печінка, нирки, селезінка, наднирники, легені, шкіра, клітини імунокомпетентної системи тощо. Втім головні ферментні системи, які приймають участь у перетворенні токсичних сполук, локалізовані у гепатоцитах, де у результаті окислювально-відновлювальних реакцій та реакцій кон’югації чужорідна хімічна речовина модифікується та елімінується екскреторними системами. Ці ферментні системи локалізовані у мітохондріях, мікросомах або гіалоплазмі. Дезінтоксикація хімічних речовин може проходити за типом хімічного окислювання, відновлення, гідролітичного перетворення або шляхом кон’югації [7,8]. Головною лабораторією, яка здійснює ці процеси є ендоплазматична мережа клітин печінки, у мікросомах якої міститься значна кількість рибонуклеїнових кислот, фосфоліпідів, білків. Головним функціональним компонентом мікросомальної мембрани є ферментативна система. В цьому зв’язку нами проведено вивчення впливу олігоефірів на мікросомальні електронно-транспортні ланцюги: НАДФ·Н- зв`язувальна система С цитохрому Р₄₅₀ у якості кінцевого ланцюга та НАД·Н-система, пов’язана з цитохромом b₅ у якості акцепторів електронів. Найбільш повно і об’єктивно активність системи мікросомального окислення може бути оцінена за швидкістю метаболізму, що відображає активність як начальних (НАДФ·Н, НАД·Н-редуктаз), так і термінальних (цитохроми) участків [3]. В якості субстрату мікросомальної Р₄₅₀ – залежної монооксигеназної системи був використаний р-нітроанізол – ксенобіотик, підвернений окислювальному деметилюванню з утворенням р-нітрофенолу, який володіє характерним спектром поглинення у лужному середовищі.

Вивчення олігоефірів на 0-деметилазну активність мікросом печінки щурів показало, що під впливом 1/100 ДЛ₅₀ вона зростала у дослідної групи тварин.

Речовини у цій дозі підвищували НАДФ·Н-цитохром С-редуктазну активність, швидкість ендогенного дихання мікросом та швидкість окислення НАДФ·Н та НАД·Н у присутності ЕДТА.

Досліджувані сполуки підвищували перекисне окислення ліпідів мікросомами печінки, вміст цитохрому Р₄₅₀ і не впливали на динаміку накопичення цитохрому b₅ (табл. 1)

Таблиця 1

Вплив 1/10 ДЛ₅₀ олігоефірів у підгострому досліді на мікросомальне окислення

Показники	Речовини (М±m)
	Контроль	Л-202	Л-1102-4-80	Л-3003-2-60	Л-4003-2-20
О-деметилаза (нмоль р-нітрофенолу/хв. мг білку)	6,69±0,64	9,12±0,43*	9,80±0,56*	8,70±0,50*	9,30±0,48*
НАДФ·Н-цитохром-C-редуктаза (нмоль цитохрому С/хв.мг білку)	141,7±8,6	195,61±0,3*	205,3±9,80*	220,4±11,6*	207,2±12,5*
НАД·Н-цитохром-C-редуктаза (нмоль цитохрому С/хв.мг білку)	690,4±25,7	810,7±43,2*	980,4±36,8*	920,5±47,8*	970,6±55,9*
Швидкість ендогенного дихання мікросом (нмоль О2)	1,40±0,12	2,70±0,25*	2,80±0,34*	3,10±0,28*	3,40±0,37
Швидкість окислення НАДФ·Н (нмоль О2)	3,32±0,41	7,20±0,65*	8,30±0,73*	9,50±0,50*	8,60±0,45*
Швидкість окислення НАДФ·Н у присутності ЕДТА (нмоль О2)	2,80±0,27	4,7±0,28*	5,3±0,30*	4,2±0,36*	3,9±0,24*
Швидкість перекисного окислення (нмоль О2)	0,42±0,11	2,9±0,16*	3,20±0,25*	1,8±0,20*	3,1±0,20*
Цитохром P-450 (нмоль/мг білку)	0,950±0,08	1,42±0,09*	1,56±0,08*	1,43±0,07*	1,60±0,12*
Цитохром b5 (нмоль/мг білку)	0,620±0,09	0,625±0,12	0,630±0,09	0,630±0,15	0,580±0,15

Примітка: *розрізняння вірогідні, р<0,05

Визначена динаміка структурно-метаболічних порушень у монооксигеназній системі свідчить про активацію вільнорадикальних процесів і накопичення активних форм кисню, які відіграють важливу роль у формуванні і розвитку патогенетичних механізмів гіпоксії органів і тканин [3].

Висновки. Таким чином, результати проведених досліджень дозволяють судити, що олігоефіри у дозі 1/10 ДЛ₅₀ активують практично усі параметри окислення ксенобіотиків у монооксигеназному та редуктазному електронно-транспортному ланцюгу мікросом гепатоцитів і стимулюють перекисне окислення ліпідів. Виявлена динаміка структурно-метаболічних порушень під впливом олігоефірів у дозі 1/10 ДЛ₅₀, може бути провідним ланцюгом формування механізмів розвитку вільнорадикальної патології, вторинними ознаками якої є багаточисленні периферичні прояви з боку різних органів, систем та функцій організму. В дозі 1/100 ДЛ₅₀ олігоефіри менш суттєво впливали на стан системи детоксикації ксенобіотиків.

Література:

1. Сидоренко Г.И. Методические и теоретические аспекты гигиены окружающей среды // Гигиена окружающей среды в СССР.- М.: Медицина, 1988.-С.5-34.

2. Komoth S.A., Narayan K.A. Interaction of Ca²⁺ with endoplasmic reticulum of rat liveri a standartised procedure for isolation of rat liver microsomas // Analyt. Biochem. 1972., Vol. 48, № 1.-H.-53-61.

3. Жуков В.И., Мясоедов В.В., Козин Ю.Н. и др. Детергенты – модуляторы радиомиметических эффектов. Белгород, 2000.-374 с.

4. Clark S.L. The thymus in immunology.-New-York, London.,1964.134P.

5. Ernster L., Siekevits Ph., Palode G.E. Enzyme-structure relation-shape in endoplasmatic reticulum of rat liver. A morphological and biochemical study // S. Molek. Biol. – 1962.-V.15.№3.-P.541-562.

6. Omura T., Sato R. The carbon monooxidebinding pigment of liver microsomos // Biol. Chem.-1964.-V.239, №7.-P.2379-2385.

7. Цыганенко А.Я., Жуков В.И., Сокол К.М. Структурно-метаболические механизмы формирования атеросклероза. Белгород. 2001. – 523с.

8. Сидоренко Г.И. Методология изучения здоровья населения // Гигиена и санитария. – 1998. - № 3. – С. 35-37.

Сведения об авторах:

Багмут Ирина Юрьевна, 1971 г.р., кандидат медицинских наук, доцент кафедры общей гигиены и эпидемиологии Харьковской медицинской академии последипломного образования.

Адрес: 61002, г. Харьков-002, ул. Фрунзе, дом 10, кв.3, д. т. 706-34-37, раб. т. 310-01-73, моб. т. 80503641187.