К вопросу о патогенезе персистирующего воспаления при хронической обструктивной болезни легких.

Н.А Распопина¹., Е.Г. Шуганов¹., А.Н Каземирский² А.Е. Шуганов¹

1- ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова. 119991,г. Москва ул. Большая Пироговская 6

2- им. Н. И. Пирогова ГОУ ВПО РГМУ Росздрава. 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д 6

Несмотря на огромное количество публикаций, посвященных изучению экспрессии поверхностных антигенов лимфоцитов периферической крови в норме при ХОБЛ, до сих пор не разработан алгоритм, позволяющий однозначно интерпретировать получаемые результаты. Этим объясняется и большое количество вопросов, ответа на которые позволят определить не только характера и причины персистирующего воспаления, но и найти патогенетически обоснованное лечение при этом заболевании.

Цель исследования: провести анализ активационного профиля лимфоцитов у больных ХОБЛ в период ремиссии и обострения.

Материалы и методы:

Исследование проводилось на пациентах 2-х групп: 1 группа-практически здоровые люди в возрасте от 16 до 56 лет (20 мужчин и 4 женщин), 2-я группа- 40 мужчин и 12 женщин страдающих ХОБЛ со 2 степенью тяжести в возрасте от 42 до 70 лет (средний возраст 56,4+1,44 года).[1]. Все пациенты с ХОБЛ имели индекс курения не менее 20 пачка-лет, у них отсутствовали данные об атопии и бронхиальной астмы в анамнезе. Забор крови проводился в период обострения ХОБЛ до назначения СГКС и/или антибиотиков и при клинически стабильном состоянии в течение последующих 4-х недель. В возрасте от 50 лет до 75 (средний возраст).

Оценка функции внешнего дыхания проводилась согласно протоколу “Стандартизация легочных функциональных тестов” Европейского Респираторного Общества с помощью спирометрии на аппарате компьютерного пневмотахографа "Custo Vit" (Австрия). В соответствии с поставленной задачей исследования использовались методы непрямой иммунофлюоресценции для определения относительного и абсолютного содержания в периферической крови лимфоцитов, экспрессирующих антигены CD3, CD4, CD8, CD16, CD20, CD56, CD72 мембранные иммуноглобулины mIgM и mIgG с помощью отечественных моноклональных антител ЛТ и ИКО в реакции непрямой иммунофлюоресценции. (Россия). Методы исследования и методика их определения описаны в предыдущих наших работах [2,3] В качестве вспомогательных методов проводилось выделение лимфоцитов по методу Boyum в градиенте плотности фиколл-верографии, оценка жизнеспособности лимфоцитов сразу после выделения из крови и подсчета их абсолютного числа в периферической крови (по критериям Фримель Г.) [4].

Результаты и обсуждение.

В основе понимания патогенеза ХОБЛ лежит так называемое «аномальное» воспаление. Эксперты GOLD последние годы констатируют, что исследование клеточных и молекулярных механизмов воспаления чрезвычайно важно для поиска лекарственных средств, способных тормозить хроническое воспаление.

Как известно, ведущими клетками воспаления при ХОБЛ являются различные лейкоциты. Для их определения и анализа мы использовали метод иммунофенотипирования клеток крови, который в настоящее время является "золотым стандартом" в диагностике иммунодефицитов, лимфопролиферативных, аутоиммунных и инфекционных заболеваний.

В соответствии с целью настоящего исследования мы провели изучение поверхностных рецепторов лимфоцитов, циркулирующих в крови у больных ХОБЛ, при этом оценивали представительство в периферической крови Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов и NK-клеток.

Как известно, популяция Т-лимфоцитов(CD3) представлена различными клонами CD3-антиген является составной частью мембрано-ассоциированной структуры антигенспецифического Т-клеточного рецептора (ТсR/CD3), обеспечивающей запуск процессов антигензависимой активации Т- клетки [5]. Другие субсистемы Т-лимфоцитов осуществляют две основные функции - регуляторную и эффекторную. Регуляторные клетки (СD4+-лимфоцитами) обеспечивают развитие иммунного ответа другими клетками, регулируют его дальнейшее течение. Они стимулируют клетки иммунной системы через продуцируемые лимфокины. Кроме того, без их помощи не может реализоваться большинство функций В-лимфоцитов. Согласно нашим данным, количество этих клеток у больных ХОБЛ и в период ремиссии и при обострении не превышает установленной нормы. (См. таблицу1).

Таблица 1

Популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови больных ХОБЛ в ремиссию и обострение (в %).

Популяции лимфоцитов	Маркеры Лимфоци-тов	Здоровые доноры n=24	Больные ХОБЛ n=35
			в стадии обострения n=35	в стадии ремиссии n=25
Т-лимфоциты	CD3 CD4 CD8	65,20±0,66 36,48±0,95 25,90±0,50	61,65±2,95 32,60±0,71* 36,23±2,54***	52,28±2,26** 37,86±2,61 32,92±1,96**
NK-клетки	CD16 CD56	13,22±0,43 4,47±0,09	25,24±3,16*** 22,18±2,13***	22,11±1,07*** 17,94±1,99***
В-лимфоциты	CD20 CD72 mIgM mIgG	10,15±0,16 10,10±0,39 5,13±0,18 6,54±0,48	26,35±1,92*** 18,56±2,34** 29,14±2,18*** 21,65±1,15***	11,56±0,61 10,34±1,40 13,13±0,99** 12,88±1,60**

Примечание: *-p<0,05; **-p<0,01; ***-p<0,001 (по сравнению с донорами)

Другая субпопуляция Т-лимфоцитов - эффекторные Т-лимфоциты (CD8+-лимфоциты) осуществляют эффект иммунологической реакции чаще всего в форме цитолиза клеточных структур, к антигенам которых возникла иммунологическая реакция. CD8+-лимфоциты - основные клетки, оказывающие цитотоксическое действие. И этот процесс у больных ХОБЛ в нашем исследовании высок, не зависимо от стадии болезни.

В норме соотношение CD8+ / СD4+-лимфоцитов равно 1:1,9/1:2,4. Однако по нашим данным у больных ХОБЛ это соотношение нарушено, и если количественное содержание СD4+ и при обострении и в период ремиссии соответствует норме, то количество CD8+ в период ремиссии болезни на 14% и 15,6% соответственно больше (см. таблицу 1).

Обе эти разновидности Т-лимфоцитов дифференцируются из общих предшественников в мозговом слое тимуса и обладают одинаковыми рецепторами для антигенов, с той лишь разницей, что рецептор CD4+-лимфоцита воспринимает антиген от представляющей клетки в комплексе с антигеном МНС II класса, а рецептор СD8+-лимфоцита - в комплексе с антигеном МНС I класса, что позволяет последним вступать во взаимодействие с любыми клетками организма. Основной функцией СD8+-лимфоцитов является цитотоксичность, это свойство они приобретают в ходе дифференцировки после контакта с антигеном. [5.6]. Благодаря цитотоксическому действию СD8+ они играют ведущую роль в противовирусном, противоопухолевом и трансплантационном иммунитете. Следовательно, при ХОБЛ преобладает цитотоксический механизм.

Итак, у пациентов с ХОБЛ, наблюдалось существенное увеличение содержания в крови цитотоксических лимфоцитов (p<0,001) на фоне более низкого, чем у здоровых людей общего содержания Т-лимфоцитов (52,28±2,27%) по сравнению со здоровыми реципиентами. При этом в крови больных ХОБЛ, несмотря на стадию ремиссии, происходит активная дифференцировка Т-лимфоцитов-CD3 на CD4⁺ CD8⁺(18,44±4,02%), что, по-видимому, является отражением чрезмерной стимуляции Т-клеточного звена иммунной системы и свидетельствует о неспецифическом, т.е. неинфекционном воспалительном процессе у этих пациентов.

Следующей разновидностью Т-лимфоцитов, которые играют значительную роль в развитии воспаления, является субпополяция NK-клеток. Эти клетки первыми настраиваются на защиту организма против чужеродных и измененных клеток. В качестве маркера NK – клеток используют поверхностный рецептор CD16, который отражает общее количество NK – клеток. О количестве активированных естественных киллерных клеток судят по экспрессии другого антигена – CD56.

Функция NK-клеток сходна с таковой цитотоксических Т-лимфоцитов, однако, в отличие от цитотоксических лимфоцитов, эти клетки не способны самостоятельно распознать клетку-мишень, если с ней не связались антитела. NK-клетки, наряду с макрофагами, нейтрофилами и эозинофилами, участвуют также и в АТ-зависимом клеточно-опосредованном цитолизе. Для этого NK-клетки экспрессируют на своей поверхности рецептор Fc-фрагмента IgG (CD 16).

При ХОБЛ существенно повышается выработка ИЛ-1 и TNF-α[7.8], что приводит к повышению активности NK-клеток, и наблюдается это как в период обострения, так и в ремиссию, свидетельствует об персистирующем активном иммунологическом. Возможно, что при ХОБЛ, высокий процент содержания NK-клеток может быть косвенным подтверждением того, что в поддержании воспалительной реакции имеет значение инфекция дыхательных путей, т.к. получены данные подтверждающие антимикробную функцию NK-клеток [9]. Согласно этим данным различные микробные продукты индуцируют нарастание активности NK-клеток. И хотя, NK-клетки могут взаимодействовать с определенными типами нормальных клеток, в первую очередь они лизируют клетки, инфицированные вирусами, тем более что, инфицированные клетки более чувствительны к лизису их естественными киллерами, чем неинфицированные. [10]

Согласно нашим данным у обследованных больных в стадии обострения ХОБЛ имеет место существенное повышение числа В-лимфоцитов всех стадий дифференцировки, что говорит об активации В-клеточного звена иммунной системы в целом (маркеры, характеризующие В-клеток антигены как CD20-, CD72-, CD38-, mIgM и mIgG).

CD20 – антиген характеризует общее количество В-лимфоцитов. И у больных ХОБЛ, согласно нашим данным в период ремиссии общее количество В-лимфоцитов соответствует норме, однако, в период обострения отмечается выраженная активация этих клеток. При этом почти в 2 раза увеличивается количество клеток несущих мембранный гликопептид CD72, биологическая роль которого заключается в активации зрелых В-лимфоцитов и в регуляции иммунного ответа при недостаточности его у новообразованных В-лимфоцитов[15.16.17]

В период ремиссии отмечено увеличение mIgM/ mIgG соответственно 5.1/6.5% против 29.1/21.7%. Все это свидетельствует о высокой иммунологической активности В-клеточного звена, отвечающего за продукцию и секрецию в кровоток антител, являющихся иммунной памятью организма.

Существенное повышение содержания в крови лимфоцитов, экспрессирующих поверхностные иммуноглобулины позволяет, в свою очередь, утверждать, что у больных ХОБЛ В-клеточная активация является отражением постоянно поддерживаемого процесса антигенной стимуляции с хроническим течением.

Если учитывать данные, что увеличение количества В-лимфоцитов, особенно несущих mIgG, наблюдается при длительных персистирующих инфекциях, то это закономерно у пациентов с частыми респираторными инфекциями и обострениями бронхита. Известно, что повышение количества В-лимфоцитов, отвечающих за продукцию и секрецию антител и за длительную антигенную память, больше свойственно для пациентов с атопией и при наличии аутоиммунных заболеваний. При выборе когорты для исследования мы исключили всех пациентов с указанием на наличие какой-либо атопии. Следовательно, повышение В-лимфоцитов отражает сам факт активного воспаления несвязанного с атопией, и подобно воспалению при аутоиммунном процессе.

Итак, на основании полученных нами данных о составе иммунокомпетентных клеток в периферической крови можно заключить, что у больных ХОБЛ 2 стадии наблюдается независящее от активности клинических проявлений заболевания существенное увеличение содержания в крови цитотоксических Т-лимфоцитов. Однако их баланс сохраняется, т.к. соотношение CD4/CD8 не выходит за диапазон нормальной величины: т.е. >1,5 и <2.

Кроме этого при ХОБЛ независимо от стадии заболевания наблюдается резкое повышение содержания в крови обеих субпопуляций NK-клеток. В стадии обострения мы наблюдали также и однонаправленное изменение всех субпопуляций В-лимфоцитов в сторону увеличения. И если лимфоциты CD20, CD72 в период ремиссии покидали кровеносное русло, то количество зрелых В-лимфоцитов ‑ антителопродуцентов и клеток иммунологической памяти сохранялось и превышало в 2 раза уровень подобных у здоровых реципиентов.

Таким образом, анализ клеточного состава и соотношения иммунокомпетентных клеток, клинические данные обследованных пациентов позволяют предположить, что ведущим механизмом воспаления при ХОБЛ является аутоиммунных механизм, постоянно поддерживаемый персистирующей инфекцией дыхательных путей и воздействием факторов внешней среды (например: курением).

Литература:

1. Global Initiative for Chronic Obstruction Lung Disease. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Pulmonary Disease / Updated 2008.(www.goldcopd.com)

2. Порядин Г.В., Солмаси Ж.М., Зильбер И.Е. и др. Особенности поверхностного фенотипа лимфоцитов при ХОБЛ . Х Международный конгресс. « Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии. С 304.20-23 мая.2009. г.Казань

3. Порядин Г.В., Солмаси Ж.М. Макарков А.И. Механизмы регуляции экспрессии поверхностных структур дифференцированного лимфоцита. Иммунологияю-1997.-№3.с.4-8

4. Фримель Г. Иммунологические методы. Перевод с нем.яз. М. «Медицина».1987.-472 с.

5. [Harnett M., Rigley.K. Thy role of G-proteins versus protein tyrosine kinases in the regulation of lymphocyte activation.// Immunol. Today. – 1992.-V.13.N.12.-P.482-486.

6. Erust P., Gonzaler A.V., Brassard P. et al Inhaled corticosteroid use in chronic obstructive pulmonary disease and the risk of hoapitalization for pneumonia. Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 2007; 176; 162-166.

7. Palyutin Sh. Ch.,. Yakusevitch V.V, Zilber I.E “Consumption of antiasthmatic drugs in Yaroslavl (Russia) in 1999-2004 years”, Basic&Clinical Pharmacology & Toxicology, Volume 97, Supplement I, 2005,# 287,p.78.

8. Palyutin Sh. Ch., Yakusevitch V.V., Zilber I.E. “ Prevalence of smoking between adults patient with bronchial asthma (Yaroslavl-study)”, World Asthma Meeting, WAM 2007 “ Briging various aspects of asthma”, 22-25 June 2007, Final program & Abstract book, TP-094, p.146.

9. Титов Л.П., Карпов И.А.] Противовирусный иммунитет: молекулярно-клеточные механизмы, закономерности развития и иммунопатология // Белорус. мед. журн. 2008. №3. С. 28—35-

10. Miadonna A. et al. Inhibitory effect of the HI antagonist loratadine on histamine release from human basophils // Int. Arch. Allergy Immunol. 2004. № 105. P. 12—17.

11. Claman H.V., James H.H., Maier T. Natural suppressor cell systems // 6th Int. Cong. Immunol. 2006. P. 1035—1039

12. Бокша В.Г. Нарушение дыхательной функции при бронхолегочных и сердечно-сосудистых заболеваниях. — Киев, 1991.-200 с

13. Katchar K, Soderstrom K., Wahlstrom J.,. Eklund , Характеристики естественных киллеров и CD56+ T-клеток у пациентов с саркоидозом. Eur Respir J 2005; 26:77-85

14. Jadab A.R., Moher M., Browman G.P., Booker L., Sigonis C., Fuentes M. et all. Systematic reviews and meta-analyses on treatment of asthma: critical evaluation BMJ 2000;320:537-40

15.Ven Kataraman C., Lu P.J., Buhl A.M., Chen C.S., Cambier J.C., Bondada S. CD72- mediated B cell activation involves recruitment of CD19 and activation of phosphatidylinositol 3-kinase.// Eur. J. Immunol.-1998-V 28, N 10, P 3003-3016.

16.Wu H.J., Ven Kataraman C., Estus S., Dong C., Davis R.J., Flavell R.A., Bondada S. Positive Signaling Through CD72 Induces Mitogen – Activated Protein Kinase Activation and Synergizes with B Cell Receptor Signals to Induce X-Linked Immunodeficiency B Cell Prolferation.//J.Immunol. – 2001 – N 167, P 1263 – 1273.