Медицина

Назаренко Р.В.

Луганский государственный медицинский университет

Изучение влияния кортексина на систему циклических нуклеотидов Т-лимфоцитов крови in vitro

Актуальность темы. Гнойно-воспалительные осложнения в хирургической патологии обусловлены выраженными сдвигами в состоянии основных защитных систем организма: иммунитета, гемостаза, неспецифической резистентности организма [1].

Нейрометаболический протектор кортексин относится к классу цитомединов и представляет собой комплекс L-аминокислот и полипептидов. Кортексин в определенных концентрациях обладает цитотоксическим и антипролиферативным действием по отношению к Т-лимфоцитам, регулирует процессы перекисного окисления в тканях и органах и препятствует образованию избыточного количества свободных радикалов [4 - 6].

Цель работы. Изучить влияние кортексина на систему циклических нуклеотидов Т-лимфоцитов крови человека in vitro.

Материал и методы исследования. Определение содержания аденозина фосфатов (АТФ, АДФ и АМФ) в нейтрофилах и моноцитах проводили методом тонкослойной хроматографии с использованием пластин «Силуфол» [3]. К 1 мл выделенным и трижды отмытым в течение 20 минут холодным изотоническим раствором натрия хлорида при скорости 3000 оборотов в минуту нейтрофилам и моноцитам добавляли 1 мл раствора хлорной кислоты, перемешивали и через несколько минут осадок отделяли центрифугированием. К 1 мл надосадочной жидкости прибавляли 0,1 мл раствора калия карбоната и оставляли на холоде, пока полностью не выпадут кристаллы образовавшегося перхлората калия. 0,05-0,1 мл холодной надосадочной жидкости наносили в виде полоски на пластину «Силуфол» и проводили восходящую хроматографию в течение 60-90 минут в смеси диоксана, изопропилового спирта и аммиака. Вынутые из камеры пластины высушивали на воздухе и просматривали в коротком ультрафиолетовом свете на ультрахемоскопе Блюмберга, находили пятна нуклеотидов и обводили их острым предметом. Порошок с отмеченных мест пластины соскабливали и элюировали 3 мл 0,1 N HCl, после чего определяли светопоглощение надосадочной жидкости при длине волны 260 нм. Расчёт проводили исходя из молярных коэффициентов экстинции.

Результаты исследования и их обсуждение. С целью изучения влияния кортексина на систему циклических нуклеотидов субпопуляций Т-лимфоцитов, данные клетки инкубировали с указанным препаратом, после чего их подвергали воздействию бактериальных эндотоксинов. Результаты исследования системы циклических нуклеотидов, полученные в конце этого эксперимента в культурах CD4+-лимфоцитов представлены таблице 1.

Таблица 1. Влияние инкубации с кортексином на циклические нуклеотиды CD4+-лимфоцитов, подвергнутых действию бактериальных эндотоксинов in vitro

Показатель		цАМФ, пмоль/6 lg клеток	цГМФ, пмоль/6 lg клеток	цАМФ/цГМФ, у.е.
Референтная норма (n=33)		1,62±0,14	2,62±0,13	0,62±0,03
Дей-ствие ТК	Интактные CD4+-лимфоциты (n=20)	2,15±0,11**	2,19±0,11*	0,98±0,05***
	CD4+-лимфоциты, инкубированные с кортексином (n=22)	1,84±0,09#	2,43±0,12	0,76±0,04**##
Дей-ствие ПГН	Интактные CD4+-лимфоциты (n=20)	2,36±0,12***	2,03±0,10***	1,16±0,06***
	CD4+-лимфоциты, инкубированные с кортексином (n=22)	1,92±0,1#	2,36±0,12#	0,81±0,04*###
Дей-ствие ЛПС	Интактные CD4+-лимфоциты (n=20)	2,63±0,13***	1,87±0,09***	1,40±0,07***
	CD4+-лимфоциты, инкубированные с кортексином (n=22)	2,17±0,11#***	2,18±0,1#*	1,00±0,05### ***

Примечания: 1. * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001 относительно референтной нормы; 2. # - р<0,05; ## - р<0,01; ### - р<0,001, рассчитано между интактными и преинкубированными с кортексином CD4+-лимфоцитами соответствующих групп.

Как следует из приведенных в табл. 1 данных, предварительная инкубация CD4+-лимфоцитов с раствором кортексина существенно снижала последующее негативное влияние бактериальных эндотоксинов. Это выражалось в менее значительных изменениях внутриклеточных концентраций цАМФ и цГМФ в CD4+-лимфоцитах, а также в улучшении баланса в системе цАМФ/цГМФ, по сравнению с аналогичными показателями для интактных CD4+-лимфоцитов, которые кортексином не обрабатывались и контактировали только с конкретным видом бактериального эндотоксина.

Более детальный анализ полученных данных позволил отметить следующее. Как оказалось, внутриклеточное содержание цАМФ в CD4+-лимфоцитах, предварительно инкубированных с кортексином и в последующем контактировавших с ТК, оказалось в 1,17 раза ниже, а содержание цГМФ – в 1,11 раза выше аналогичных показателей в культурах интактных CD4+-лимфоцитов (р<0,05 только в первом сравнении). При этом абсолютные показатели цАМФ и цГМФ в культурах CD4+-лимфоцитов не имели существенных различий с показателями референтной нормы, тогда как в культурах интактных CD4+-лимфоцитов уровни изучаемых циклических нуклеотидов были достоверно изменены. Также следует отметить, что позитивные сдвиги в системе циклических нуклеотидов сопровождались улучшением коэффициента цАМФ/цГМФ, который у CD4+-лимфоцитов, инкубированных с кортексином, был в 1,23 раза выше референтной нормы, но в 1,29 раза ниже аналогичного показателя для культур интактных CD4+-лимфоцитов.

Сходные позитивные изменения в системе циклических нуклеотидов были зарегистрированы в культурах CD4+-лимфоцитов, обработанных кортексином, и в опытах с ПГН S. haemolyticus.

Так, внутриклеточная концентрация цАМФ в CD4+-лимфоцитах, взаимодействовавших с кортексином и ПГН, составляя в среднем 1,92±0,1 пмоль/6 lg клеток, оказалась в 1,19 раза выше показателя референтной нормы, но в 1,23 раза ниже концентрации цАМФ в интактных CD4+-лимфоцитах (р>0,05 и р<0,05, соответственно). Внутриклеточное содержание цГМФ в CD4+-лимфоцитах, предварительно инкубированных с кортексином а затем контактировавших с ПГН, оказалось в конце опытов сниженным относительно референтной нормы лишь в 1,1 раза (р>0,05), превышало уровень цГМФ в интактных CD4+-лимфоцитах в 1,16 раза; (р<0,05). Вследствие данных изменений, коэффициент цАМФ/цГМФ для CD4+-лимфоцитов, контактировавших с кортексином, составил в среднем 0,81±0,04 у.е., против 1,16±0,06 у.е. для интактных CD4+-лимфоцитов (кратность различия – 1,43 раза, р<0,001). В то же время, коэффициент цАМФ/цГМФ для культур CD4+-лимфоцитов, контактировавших с кортексином, был выше референтной нормы в 1,31 раза, против 1,87 раза для культур интактных CD4+-лимфоцитов (р<0,05 и р<0,001, соответственно).

Таким образом, предварительная инкубация CD4+-лимфоцитов с кортексином существенно снижала негативное влияние последующего действия ПГН, но полностью его не отменяла, что проявлялось остаточно изменёнными внутриклеточными уровнями цАМФ и цГМФ, а также наличием остаточного дисбаланса между данными фракциями циклических нуклеотидов.

Позитивное влияние кортексина на систему циклических нуклеотидов чётко прослеживалось и в опытах с ЛПС B. merdae.

Так, внутриклеточная концентрация цАМФ в CD4+-лимфоцитах, имевших контакт с кортексином и ЛПС, в конце эксперимента, составив в среднем 2,17±0,11 пмоль/6 lg клеток, оставалась выше референтной нормы в 1,34 раза, но также была в 1,21 раза ниже аналогичного показателя в культурах интактных CD4+-лимфоцитов (в обоих сопоставлениях различия статистически значимы). Примечательно также, что зарегистрированный уровень цАМФ был в 1,13 и в 1,18 раза выше уровней цАМФ в CD4+-лимфоцитах, контактировавших с кортексином, но в последующем взаимодействовавших с ПГН и ТК, соответственно (р>0,05 и р<0,05). То есть, не смотря на позитивные сдвиги, обусловленные действием кортексина, степень остаточных нарушений внутриклеточного содержания цАМФ в CD4+-лимфоцитах в опытах с ЛПС была наибольшей.

Динамика изменений цГМФ в культурах CD4+-лимфоцитов, подвергавшихся воздействию кортексина, была следующей. Как оказалось, в конце эксперимента уровень цГМФ в CD4+-лимфоцитах, инкубированных с кортексином, а в последующем контактирующих с ЛПС, составил в бреднем 2,18±0,1 пмоль/6 lg клеток, против 1,87±0,09 пмоль/6 lg клеток в культурах интактные CD4+-лимфоцитов (степень различия относительно показателя референтной нормы, соответственно 1,20 и 1,40 раза). При этом уровень цГМФ в CD4+-лимфоцитах, инкубированных с кортексином, был 1,17 раза выше, чем у интактных клеток (р<0,05). Кроме того, зарегистрированная внутриклеточная концентрация цГМФ была также в 1,13 (р>0,05) и в 1,18 раза (р<0,05) выше аналогичных показателей в культурах CD4+-лимфоцитов, предварительно инкубированных с кортексином и в последующем контактировавших с ПГН и ТК, соответственно.

Выявленные позитивные сдвиги внутриклеточных концентраций цАМФ и цГМФ в CD4+-лимфоцитах, взаимодействовавших с кортексином и ЛПС, сопровождались улучшением коэффициента цАМФ/цГМФ. Последний в конце эксперимента составил в среднем 1,00±0,05 у.е., что было в 1,61 раза выше аналогичного показателя референтной нормы, а также в 1,4 раза ниже подобного коэффициента для культур интактных CD4+-лимфоцитов (в обоих сопоставлениях р<0,001). Приведенный коэффициент цАМФ/цГМФ был также в 1,23 и в 1,32 раза выше аналогичных коэффициентов в культурах CD4+-лимфоцитов, контактировавших как с кортексином и, соответственно, с ПГН и ТК (различия статистически значимы в обоих сопоставлениях).

Таким образом, предварительная инкубация CD4+-лимфоцитов периферической крови человека in vitro с раствором кортексина положительно влияет на систему циклических нуклеотидов данных клеток при последующем их контакте с бактериальными эндотоксинами. Позитивное влияние кортексина выражалось, как в менее значительном нарушении внутриклеточного содержания цАМФ и цГМФ, так в менее выраженном дисбалансе системы цАМФ/цГМФ, по сравнению с таковыми для CD4+-лимфоцитов, с кортексином не инкубированных. При относительно стабильном корригирующем потенциале кортексина, наибольший позитивный эффект от его использования наблюдался в культурах CD4+-лимфоцитов, взаимодействовавших в последующем с ТК, тогда как наименьший позитивный эффект регистрировался при взаимодействии с ЛПС.

Результаты исследования влияния кортексина на систему циклических нуклеотидов CD8+-лимфоцитов представлены в таблице 2.

Как и в случае с CD4+-лимфоцитами, так и в случае с CD8+-лимфоцитами, под влиянием кортексина последующее воздействие на указанные клетки ТК, ПГН и ЛПС вызывало менее значительное нарушение в системе циклических нуклеотидов, чем это наблюдалось в интактных CD8+-лимфоцитах, контактировавших только с каким-либо одним из видов бактериальных эндотоксинов.

Таблица 2. Влияние инкубации с кортексином на циклические нуклеотиды CD8+-лимфоцитов, подвергнутых действию бактериальных эндотоксинов in vitro

Показатель		цАМФ, пмоль/6 lg клеток	цГМФ, пмоль/6 lg клеток	цАМФ/цГМФ, у.е.
Референтная норма (n=33)		4,42±0,22	0,94±0,05	4,70±0,23
Дей-ствие ТК	Интактные CD8+-лимфоциты (n=20)	5,06±0,25	1,12±0,06*	4,51±0,23
	CD8+-лимфоциты, инкубированные с кортексином (n=22)	4,38±0,22#	0,91±0,05#	4,81±0,24
Дей-ствие ПГН	Интактные CD8+-лимфоциты (n=20)	5,21±0,26*	1,23±0,06***	4,24±0,21
	CD8+-лимфоциты, инкубированные с кортексином (n=22)	4,75±0,18	1,05±0,05#	4,52±0,23
Дей-ствие ЛПС	Интактные CD8+-лимфоциты (n=20)	5,43±0,27**	1,36±0,07***	3,99±0,20*
	CD8+-лимфоциты, инкубированные с кортексином (n=22)	4,96±0,25	1,11±0,05##*	4,47±0,22

Примечания: 1. * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001 относительно референтной нормы; 2. # - р<0,05; ## - р<0,01; ### - р<0,001, рассчитано между интактными и преинкубированными с кортексином CD8+-лимфоцитами соответствующих групп.

Наибольший позитивный эффект от применения кортексина регистрировался в опытах с CD8+-лимфоцитами, подвергшимися в последующем воздействию ТК S. haemolyticus. Наименьший положительный эффект наблюдался в опытах с CD8+-лимфоцитами, взаимодействующих с кортексином и ЛПС B. merdae.

Более детальный анализ полученных результатов исследования позволил отметить следующее. Как следует из данных, приведенных в таблице 2, в культурах CD8+-лимфоцитов, контактировавших последовательно с кортексином и ТК S. haemolyticus, внутриклеточные концентрации цАМФ и цГМФ в конце эксперимента существенно достоверных различий с аналогичными показателями референтной нормы не имели, а коэффициент цАМФ/цГМФ, составляя в среднем 4,81±0,24 у.е. был недостоверно (в 1,02 раза) выше соответствующей референтной нормы. Наряду с этим, зарегистрированные показатели цАМФ, цГМФ для культур CD8+-лимфоцитов, контактировавших с кортексином и ТК, были соответственно в 1,16 и в 1,23 раза ниже аналогичных показателей в культурах интактных CD8+-лимфоцитов, контактировавших только с ТК (р<0,05 в обоих случаях сопоставления). Подобная кратность различия для коэффициентов цАМФ/цГМФ составила 1,02 раза (р>0,1).

Менее выраженный положительный эффект от предварительной инкубации CD8+-лимфоцитов с кортексином был отмечен в опытах с ПГН S. haemolyticus. Как оказалось, в CD8+-лимфоцитах, подвергавшихся предварительной инкубации с кортексином, а в последующем контактировавших с ПГН, внутриклеточная концентрация цАМФ и цГМФ оказалась повышенной против аналогичных показателей референтной нормы в 1,07 и в 1,12 раза соответственно, что статистически достоверным не являлось, и было расценено как полная их нормализация. Вследствие указанных сдвигов во фракционном составе циклических нуклеотидов, коэффициент цАМФ/цГМФ для CD8+-лимфоцитов, составляя в среднем 4,52±0,23 у.е., был в 1,04 раза ниже соответствующего показателя референтной нормы, что также статистически достоверным не являлось.

Также оказалось, что в CD8+-лимфоцитах, подвергавшихся предварительной инкубации с кортексином, а в последующем контактировавших с ПГН, внутриклеточное содержание цАМФ было ниже такового у интактных CD8+-лимфоцитов в 1,1 раза, а содержание цГМФ – ниже в 1,17 раза (р>0,05 и р<0,05, соответственно). Для коэффициента цАМФ/цГМФ степень превышения подобного коэффициента для культур интактных CD8+-лимфоцитов составила 1,07 раза, что статистически достоверным не являлось.

Позитивное влияние кортексина наблюдалось и в отношении системы циклических нуклеотидов в культурах CD8+-лимфоцитов в последующем взаимодействовавших с ЛПС B. merdae.

Так, после контакта с ЛПС в CD8+-лимфоцитах, предварительно инкубированных с кортексином, внутриклеточное содержание цАМФ, составляя в среднем 4,96±0,25 пмоль/6 lg клеток, оказалось 1,09 раза ниже, чем это имело место в культурах интактных CD8+-лимфоцитов, но также было в 1,12 раза выше аналогичного показателя референтной нормы. В обоих случаях различия статистически значимой разницы не имели.

В то же время, внутриклеточная концентрация цГМФ в культурах CD8+-лимфоцитов, предварительно инкубированных с кортексином, а в последующем взаимодействовавших с ЛПС B. merdae, составила в среднем 1,11±0,07 пмоль/6 lg клеток, оказавшись тем самым в 1,23 раза ниже аналогичного показателя в культурах интактных CD8+-лимфоцитов (р<0,01). Приведенный показатель оставался также в 1,18 раза выше показателя референтной нормы (р<0,05), тогда как в культурах интактных CD8+-лимфоцитов подобная степень превышения составляла 1,45 раза (р<0,001).

Вследствие указанных изменений коэффициент цАМФ/цГМФ для CD8+-лимфоцитов, предварительно инкубированных с кортексином и контактировавших с ЛПС, в конце опыта, составив в среднем 4,47±0,22 у.е., оказался в 1,12 раза выше аналогичного показателя для культур интактных CD8+-лимфоцитов, но в 1,05 раза ниже показателя референтной нормы (в обоих сопоставлениях р>0,05). В то же время, коэффициент цАМФ/цГМФ для культур интактных CD8+-лимфоцитов был ниже референтного показателя в 1,18 раза (р<0,05).

Таким образом, бактериальные эндотоксины (ТК и ПГН S. haemolyticus и ЛПС B. merdae) при непосредственном контакте in vitro с субпопуляциями Т-лимфоцитов периферической крови человека вызывают изменение внутриклеточного содержания цАМФ и цГМФ, что сопровождается сдвигом интегрального коэффициента цАМФ/цГМФ, характеризующего баланс в системе циклических нуклеотидов.

Выявленные нарушения были неодинаковы по своей направленности в CD4+- и в CD8+-лимфоцитах. Под воздействием бактериальных эндотоксинов в субпопуляции CD4+-лимфоцитов внутриклеточная концентрация цАМФ увеличивалась, а внутриклеточная концентрация цГМФ - снижалась, что сопровождалось повышением коэффициента цАМФ/цГМФ. В субпопуляции CD8+-лимфоцитов под влиянием бактериальных эндотоксинов происходило увеличение внутриклеточных концентраций и цАМФ, и цГМФ, что сопровождалось снижением коэффициента цАМФ/цГМФ. Наибольшее негативное влияние на систему циклических нуклеотидов CD4+-лимфоцитов и CD8+-лимфоцитов оказывали ЛПС B. merdae, умеренное – ПГН S. haemolyticus, наименьшее – ТК S. haemolyticus.

Выводы. Предварительная инкубация CD4+- и CD8+-лимфоцитов с раствором кортексина снижала негативное влияние бактериальных эндотоксинов на систему циклических нуклеотидов этих клеток. Под воздействием кортексина изменения внутриклеточных концентраций цАМФ и цГМФ в субпопуляхиях CD4+- и CD8+-лимфоцитов были существенно ниже, что заметно улучшало баланс в системе цАМФ/цГМФ.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Белобородов В.Б. Клинико-лабораторное обоснование и практика лечения тяжелых инфекций, вызванных стафилококками / В.Б. Белобородов // Инфекции в хирургии – 2011. – N 4. – С. 14-19.

2. Бирюков А.В. Роль системы циклических нуклеотидов в иммунорегуляторных процессах и методические подходы к её изучению при оценке иммунного статуса человека / А.В. Бирюков, М.А. Стенина, А.Ю. Скрипник [и др.] // Лабораторное дело. – 1985. – № 1. – С. 29-35.

3. Евгеньев М.И. 5-Хлор-4,6-динитробензофуразан как реагент в тонкослойной хроматографии ароматических аминов / М.И. Евгеньев, И.И. Евгеньева, Н.А. Москва, Ф.С. Левинсон // Завод. лаб., 1992. – Т. 58, № 4. – С. 11-13.

4. Кортексин (нейропротекция на молекулярном уровне) / О.К. Гранстрем, Е.Г. Сорокина, М.А. Салыкина, Т.П. Сторожевых, А.М. Сурин, Г.В. Штучная, В.П. Реутов, Крушинский А.Л., Кузенков В.С., Пинелис В.Г., М.М. Дьяконов // Нейроиммунология. – 2010. – Т. VIII, № 1–2. – С. 34-40.

5. Макаренко А.Н. Цитопротекторное действие нейропептидов на иммунокомпетентные клетки (исследование in vitro) / А.Н. Макаренко //Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2009. – N. 4. – С. 28-32.

6. Пептидные биорегуляторы и их применение: от неонаталогии до геронтологии / В.М. Студеникин, Л.А. Пак, С.Ш. Турсунхужаева, В.И. Шелковский, С.В. Балканская // Лечащий врач: Клиническая фармакология. – 2010 – №6. – C. 72-75.