Биологические науки/6. Микробиология

К.б.н. О. В. Топкова, к.б.н. В. А. Колодязная

ГОУ ВПО Санкт-Петербургская государственная

химико-фармацевтическая академия, Россия

Синтетическая среда для биосинтеза неполиенового антибиотика имбрицина

В производстве антибиотиков применяют исключительно комплексные питательные среды. Однако для изучения особенностей метаболизма у микроорганизмов – продуцентов биологически активных веществ и процессов, связанных с биогенезом, целесообразно использовать синтетические среды определенного химического состава. Комплексные среды, в состав которых входят сложные органические компоненты, такие как кукурузная и соевая мука, кукурузный экстракт и тому подобные вещества, трудно стандартизировать и повторять результаты эксперимента от опыта к опыту.

В настоящее время нами проводятся исследования механизма сверхсинтеза неполиенового противогрибкового антибиотика имбрицина под действием ауторегулятора, образуемого продуцентом Streptomyces imbricatus [1,2]. Работы по изучению влияния ауторегулятора на рост продуцента и синтез антибиотика необходимо проводить на простых по составу питательных средах, исключающих использование каких-либо сложных органических веществ. Кроме того, уровень антибиотикообразования на синтетической среде должен быть близок к аналогичному показателю при культивировании продуцента на комплексной среде.

Целью данной работы явилось создание синтетической питательной среды, отвечающей вышеперечисленным требованиям, для биосинтеза неполиенового противогрибкового антибиотика имбрицина.

В работе использовали продуцент неполиенового антибиотика имбрицина S. imbricatus ЛИА 0112/9М.

Для исследования зависимости образования имбрицина от концентрации компонентов среды, отобранных на основе монофакторных экспериментов, была составлена матрица планирования эксперимента по методу ортогональных латинских прямоугольников [3] по схеме 8´4, включающая глюкозу, крахмал, аммоний сернокислый, магий сернокислый, калия хлорид, натрий азотнокислый, цинк сернокислый, кальция карбонат (мел) на разных уровнях. Эффект антибиотикообразования рассчитывали для каждого фактора каждого уровня и определили их оптимальные значения (табл.1).

Таблица 1

Зависимость эффектов антибиотикообразования от концентрации компонентов питательной среды

Глюкоза	%	3,0	3,5	4,0	4,5
	Эффект	- 293	- 168	- 31	+207
Крахмал	%	4,0	4,5	5,0	5,5
	Эффект	- 156	- 37	+ 51	+ 143
(NH4)2SO4	%	0	0,05	0,1	0,2
	Эффект	+ 27	+ 160	+ 89	- 276
MgSO4	%	0	0,05	0,1	0,2
	Эффект	+ 80	- 28	- 52	- 68
KCl	%	0	0,2	0,4	0,6
	Эффект	- 159	- 138	+ 72	- 144
NaNO3	%	0	0,1	0,2	0,3
	Эффект	+ 126	+14	- 58	- 123
ZnSO4	%	0	0,01	0,025	0,05
	Эффект	+ 76	- 33	- 104	- 117
CaCO3 (мел)	%	0,4	0,6	0,8	1,0
	Эффект	- 109	+ 13	+ 108	+ 16

Анализ рассчитанных эффектов показал, что 5 факторов из 8-ми, а именно: глюкоза, крахмал, аммоний сернокислый, калий хлористый и мел - были значимыми и влияли на выход имбрицина.

Вместе с тем, такие компоненты среды как магний сернокислый, натрий азотнокислый и цинк сернокислый не оказывали влияния на выход антибиотика, следовательно, их можно не включать в состав разрабатываемой синтетической среды.

Зависимости «эффект-концентрация» для аммония сернокислого, калия хлористого и мела носили ярко выраженный параболический характер, что свидетельствовало о статистической достоверности полученных данных.

Для таких факторов среды, как глюкоза и крахмал оптимальными оказались самые высокие концентрации – 4,5 и 5,5 % соответственно. Это свидетельствовало о том, что целесообразно проведение серии опытов по уточнению оптимальных концентраций данных компонентов в подобранной синтетической среде. Однако, после определения содержания редуцирующих веществ на момент окончания ферментации (96 часов), убедились, что к этому времени большое количество редуцирующих сахаров остается не утилизированным. В культуральной жидкости в этот период ферментации общее количество редуцирующих веществ было достаточно высоким и составляло 4,6 % против 12,4 % в исходной среде. Следовательно, дальнейшее увеличение концентрации глюкозы и крахмала в питательной среде нецелесообразно.

Таким образом, на основании проведенных исследований предложена новая синтетическая среда для биосинтеза имбрицина культурой S. imbricatus, на которой уровень антибиотикообразования составлял 1890±90 мкг/мл, что близко к показателям активности на богатой комплексной среде (табл. 2).

Хорошо известно, что сверхсинтез антибиотиков у многих актиномицетов зависит от наличия в питательной среде фосфата. Многие продуценты очень чувствительны к содержанию в среде неорганического фосфора. При избытке или недостатке неорганического фосфора уменьшается синтез ряда антибиотиков, и изменяются морфологические и физиологические особенности самого продуцента [4, 5]. В связи с этим были проведены опыты по изучению влияния различных концентраций неорганического фосфора на биосинтез имбрицина.

Таблица 2

Сравнение состава синтетической и комплексной питательных сред

для биосинтеза имбрицина

Компоненты питательной среды	Содержание компонентов, %
	Комплексная среда	Синтетическая среда
Соевая мука Кукурузная мука Глюкоза Крахмал CaCO3 (NH4)2SO4 KCl	2,0 4,0 5,0 - - - -	- - 4,5 5,5 0,8 0,05 0,4
Количество образующегося имбрицина, мкг/мл	2500 ± 125	1890 ± 90

Неорганический фосфор вносили в питательную среду в виде 1 %-го раствора однозамещенного фосфата калия в концентрациях от 0,01 до 0,1 %.

Полученные данные (табл. 3) свидетельствуют, что культура S. imbricatus может осуществлять биосинтез антибиотика на достаточно высоком уровне без внесения в питательную среду источника неорганического фосфора.

Концентрация фосфора, колеблясь в широком интервале от 2,28 до 22,8 мг%, не оказывает существенного влияния на уровень антибиотикообразования. Можно сделать вывод, что продуцент имбрицина S. imbricatus относится к ряду актиномицетов, малочувствительных к содержанию фосфора в среде. К таким актиномицетам – продуцентам БАВ – относится, например, продуцент олеандомицина S. antibioticus ОЛ-1, для которого оптимальная концентрация фосфора в среде составляет 18-20 мг %, и биосинтез лишь незначительно снижается при концентрации фосфора на уровне 40 мг % .

Таблица 3

Влияние неорганического фосфора на биосинтез имбрицина

Содержание в среде однозамещенного фосфата калия, %	Концентрация в среде неорганического фосфора, мг %	Количество образующегося имбрицина, мкг/мл
0 0,01 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1	0 2,28 4,56 9,12 13,68 18,24 22,80	1890 ± 90 1820 ± 90 1830 ± 85 1820 ± 90 1870 ± 95 1750 ± 65 1640 ± 80

Литература

1. Топкова, О. В. Изучение биосинтез неполиенового антибиотика имбрицина на среде, содержащей фильтрат культуральной жидкости продуцента / О. В. Топкова, Е. П. Яковлева, Г. А. Яскович // Антибиотики и химиотерапия. – 2000. – Т.45, № 10. – С. 5-9.

2. Топкова, О. В. Выбор способа выделения ауторегулятора из фильтрата культуральной жидкости Streptomyces imbricatus / О. В. Топкова и др. // Естественные и технические науки. – 2006. - № 3. – С.65-69.

3. Бирюков, В. В. Основы промышленной биотехнологии. – М. : КолосС, 2004. – 296 с.

4. Gil, J.A., Campelo-Diez, A.B. Candicidin biosynthesis in Streptomyces griseus // Appl. Microbiol. and Biotechnol. - 2003. - V.60, № 6. - P.633-642.

5. Fjaervik, E., Zotchev, S.B. Biosynthesis of the polyene macrolide antibiotic nystatin in Streptomyces noursei // Appl. Microbiol. and Biotechnol. - 2005. -V.67, № 4. - Р.436-443.