Мусабеков А.Т. докторант (PhD)

Южно-Казахстанский государственный университет им. М.Ауезова

влияние компонентов среды на повышение

криозащитных свойств спермы хряков

По обобщенным данным [1] эффективным криозащитным свойством при замораживании большинства биологических объектов обладают сахара. Криозащитный эффект сахаров в значительной степени зависит от видовой специфичности замораживаемых клеток и тканей, составляющих компонентов среды замораживания, а также режима замораживания [2];. Исследованиями ряда авторов [3,4,5] показано, что хорошими защитными свойствами обладают среды с дисахарами.

Сперму замораживали в среде ГХЦЖКМ имеющий следующий состав: глюкоза–50,5; натрия цитрат трехзамещенный–2,78г; калия цитрат двухзамещенный–0,65г; хелатон-1,0г; мочевина-3,0г; вода дистиллированная– 1000 мл.

Оценивали изменения ферментов лактатдегидрогеназы (ЛДГ) сперматозоидов до и после замораживания на жидком азоте (-196 ⁰С) и оттаивания при комнатной температуре. С целью изыскания возможностей увеличения криозащитного действия среды ГХЦЖКМ нами было изучено влияние ряда защитных веществ (сахара и их сочетания, многоатомные спирты) на активность и время переживания замороженно-опттаянной спермы.

В результате исследования установлено, что замена в ГХЦЖКМ среде глюкозы на сахарозу, лактозу, мальтозу или раффинозу уменьшает активность и время переживания на 10-40% (табл. 1). Эффективным оказалось сочетание глюкозы с сахарозой при соотношении изотонических концентраций 3:1 или сахарозы с фруктозой в соотношении 1:1. В этом варианте, как видно из табл. 1, активность семени после замораживания увеличивается на 24%, время переживания - на 10% сверх контрольной группы с глюкозой. Многоатомные спирты (инозит, сорбит, маннит) не дали положительного эффекта.

Таблица 1. Влияние замены глюкозы в ГХЦЖКМ среде на различные сахара и их сочетания на активность и время переживания сперматозоидов после размораживания

Сахара и их сочетания	Изотоническая концентрация и их сочетание	Активность сперматозоидов		Время переживания сперматозоидов
		балл	%	час	%
Контроль (глюкоза)	5	2,9	100,0	2,4	100,0
Сахароза	11	1,9	67,8	1,4	58,2
Лактоза	11	1,8	64,9	1,6	66,1
Фруктоза	5	3,3	117,0	2,2	91,4
Мальтоза	11	2,6	93,1	1,5	61,9
Раффиноза	15	2,2	74,6	2,5	104,0
Контроль (глюкоза)	1:0	3,6	100,0	3,0	100,0
Глюкоза + сахароза	1:1	3,2	86,0	2,5	92,8
Глюкоза + сахароза	3:1	4,1	113,1	3,0	100,0
Глюкоза + сахароза	1:3	2,5	69,7	2,3	75,9
Сахароза + фруктоза	1:1	4,5	124,1	3,3	110,0
Сахароза + фруктоза	3:1	3,3	90,8	2,5	82,8
Сахароза + фруктоза	1:3	2,8	77,6	1,6	53,1

Исследование влияния быстрого снижения температуры спермы до 5...2° С - "холодового шока" - на активность ЛДГ в сперме хряков показало, что выход фермента из сперматозоидов сразу после холодового шока составляет 9...25% (табл. 3), что меньше чем выход ЛДГ после эквилибрации (медленного охлаждения), когда выход фермента из сперматозоидов доходил до 42%.

Таблица 3. Влияние температурного шока и замораживания-оттаивания спермы хряков на активность ЛДГ сперматозоидов

Сперма	Общая активность ЛДГ в мкМ на 10^9 клеток
	М±m	lim	%
Свежеразбавленная	13,1±1,4	10,2-15,0	100,0
После холодового шока	105±1,5	8,9-12,6	80,1
После замораживания-оттаивания	6,3±0,8	4,8-7,6	48,1

По-видимому выход фермента ЛДГ из сперматозоидов в плазму при охлаждении спермы происходит не одномоментно, вследствие повреждения мембранных структур сперматозоидов, а является более длительным температурно-зависимым процессом диффузионного характера.

Проверка влияния защитных компонентов среды желтка и глицерина на активность ЛДГ в ГХЦЖКМ среде при замораживании-оттаивании спермы хряков, а также в период эквилибрации, выявила различный характер защитного действия этих двух компонентов среды. Как показывают результаты опытов (табл. 4), желток не оказывает защитного действия при охлаждении и замораживании-оттаивании спермы в отношении "аэробных" нзоферментов ЛДГ₁ и ЛДГ₂ сосредоточенных в митохондриях сперматозоидов, в то время как глицерин предохраняет данные изоферменты от инактивации.

Об этом говорит тот факт, что в период эквилибрации спермы в среде с глицерином и желтком и в среде с глицерином без желтка активность ферментов ^: ЛДГ₁ и ЛДГ₂ в клетках находится на одном уровне – ЛДГ₁- 3,7%, в среде с желтком + глицерин и 3.9% - с глицерином без желтка, ЛДГ₂ соответственно - 2,8% и 3,3%. Такая же картина наблюдается и при замораживании-оттаивании. Изоферменты "анаэробного" типа ЛДГ₅ и ЛДГ₄, которые в основном сосредоточены в цитоплазме клеток, лучше сохраняют активность после замораживания-оттаивания спермы в среде содержащей желток. Это показывает, что при охлаждении и замораживании-оттаивании сперматозоидов желток предохраняет внешние мембранные структуры клеток предотвращая утечку ферментов из сперматозоидов. А глицерин предохраняет от повреждения внутриклеточные мембранные структуры и ферменты. Известно, что глицерин защищает лактатдегидрогеназу от инактивации при охлаждении и замораживании-оттаивании [6]. С этим согласуются и результаты наших исследовании.

Таблица 4.

Влияние защитных компонентов среды и глицерина на изоферментный спектр ЛДГ

сперматозоидов при охлаждении и замораживании-оттаивании спермы хряка

Сперма	Защитные компоненты	Активность изоферментов ЛДГ в %
		клетки							плазма
		ЛДГ1	ЛДГ2	ЛДГ3	ЛДГ4	ЛДГ5	% Σ	М/Н	ЛДГ1	ЛДГ2	ЛДГ3	ЛДГ4	ЛДГ5	% Σ	М/Н
Свежеразбав--ленная	глицерин + желток	5,5	3,5	15,4	34,8	38,7	100	3,0	9,3	8,4	18,2	48,9	14,9	100	1,7
Эквилибри-рованная (+5 С)	глицерин + желток	3,9	2,6	5,7	31,9	26,1	70	3,3	10,8	8,4	26,4	55,5	22,0	121	1,8
	желток	2,8	1,9	8,8	25,6	26,5	65	3,5	9,9	8,4	21,2	53,1	31,0	122	2,1
	глицерин	4,1	3,1	6,4	24,6	20,6	59	2,9	14,2	12,3	18,6	19,4	36,6	129	1,9
После замораживания- оттаивания	глицерин + желток	3,6	2,6	7,4	20,8	12,3	45	2,1	12,1	10,6	25,7	52,1	49,6	148	2,3
	Желток	2,4	1,9	9,1	26,0	22,6	60	3,1	5,9	3,6	18,6	46,0	36,7	110	2,8
	глицерин	3,3	2,6	5,6	21,0	9,4	42	2,4	15,6	12,3	36,0	47,1	36,0	144	1,7

Из табл. 4 видно, ч го суммарная активность ЛДГ в плазме спермы после замораживания-оттаивания лучше сохраняется в среде содержащий глицерин - (144%) и глицерин с желтком (148%) по сравнения со средой не содержащей глицерин (110%).

Таким образом, результаты проведенных экспериментов показали перспективность введения в состав среды ГХЦЖКМ сахарозы и фруктозы взамен эквивалентного количества глюкозы. Кроме того также установлены, что при замораживании спермы хряков охлаждение и замораживание оттаивание спермы приводит к утечке фермента лактатдегидрогеназы из клеток и частичной ее инактивации. Показатель сохранности ЛДГ в сперматозоидах может служит критерием оценки качества криоконсервированной спермы и использован при разработке методов долговременного хранения спермы.

Литература

1. Лозино-Лозинский Л.К. Очерки по криобиологии. Л: Наука, 1972.- 287 с.

2. Пушкарь Н.С., Белоус А.М. Введение в криобиологию.–Киев: Наукова думки. 1975–343 с.

3.БарановФ.А. Впервые получены поросята от искусственного осеменения замороженным семенем.//Животноводство.-1972.№2,С.68-69

4.Кононов В. Голышев Н., Хачапуридзе Э. Оборудование для глубокого замораживания спермы хряка //Свиноводство. №11. - .25-26

5.Ригsе1 М., Jоhnsоn L. Freezing of boar spermatozoa fertilizing capaccity with concentrated semen and new thawing procedure // J. Anim. Sci.–V.115.-P.163-184.

6.Милованов В.К. Биология воспроизведения и искусственное осеменение сельскохозяйственных животных. М.: Сельхозгиз, 1962 -696 с.

Summary

Installed promise of introducing into the environment GHTSZHKM sucrose and fructose instead of the equivalent amount of glucose. Shown that by freezing the sperm of male pigs. cooling and freezing thawing sperm leads to leakage of the enzyme lactate dehydrogenase from cells and its partial inactivation. Index preservation of LDH in sperm can be used criterion for evaluating the quality of cryopreserved sperm