Мусабеков А.Т. докторант (PhD)

Южно-Казахстанский государственный университет им. М.Ауезова

применение диализного метода разбавления для повышения криозащитных свойств спермы хряков

Аннотация

Установлено, что в процессе замораживания-оттаивания в сперматозоидах происходят значительные деструктивные изменения мембранных структур, в результате чего происходит быстрый гидролиз АТФ под действием содержащихся в клетках и семенной плазме ферментов. Эти изменения можно в определенной степени снизить применяя диализного метода разбавления спермы перед замораживанием.

Summary

Established that in the process of freezing and thawing in spermatozoa undergoing considerable destructive changes in membrane structures, resulting in rapid hydrolysis of ATP under the action contained in the cells and seminal plasma enzymes. These changes can to some extent, reduce the dilution method using dialysis sperm before freezing.

Прослушать

На латинице

Известно, что в оценке качество спермы сельскохозяйственных животных важным критерием является синтез макроэргов (АТФ). Уровень АТФ и функциональное состояние энергетической системы, как было показано, в ряде работах [1, 2, 3] имеют высокую связь с подвижностью и оплодотворяющей способностью сперматозоидов. Высокий уровень окислительных процессов и большая чувствительность механизмов сопряжения окисления с синтезов АТФ, низкая лабильность аденилатциклазной системы в сперме хряков являются причинами быстрого нарушения окислительного обмена и дисбаланса в работе ферментных систем, нарушения проницаемости и транспорта ионов в мембранах при разбавлении, быстрого охлаждении и замораживании спермы.

В связи этим и совершенствованием методов криоконсервации спермы хряков представляет несомненный практический интерес изучение динамики содержания АТФ в сперматозоидах под влиянием глубокого замораживания в зависимости от методов криоконсервации.

Целью наших экспериментов было изучение содержания АТФ в нативных и подвергнутых замораживанию различными способами сперматозоидах хряков.

Эксперименты проведены на сперме хряков крупной белой породы в свиноводческих хозяйствах «Дидар» и «Достык» Сайрамского района Южно-Казахстанской области. В связи с отсутствием АТФ в семенной плазме, предварительное отделение сперматозоидов от плазмы не проводилось. Экстрагирование АТФ из сперматозоидов проводилось по методу Угаровой с соавторами (1991). Для этого из каждого образца спермы отбирали пробу объёмом 0,05 мл и добавляли в неё 0,45 мл диметилсульфоксида. После 20 минутной экстракции при комнатной температуре определяли содержание АТФ биолюминисцентным методом с помощью портативного люминометра ЕМILIТЕ-1003А (Россия).

Результаты эксперимента по изучению содержания АТФ в сперматозоидах хряков представлены в таблице 1.

Из таблицы 1 видно, что в процессе замораживания-оттаивания происходит резкое снижение уровня АТФ в сперматозоидах хряков. Через 5 минут после оттаивания уровень АТФ снизился на 38% по сравнению с нативными образцами. При этом также уменьшилась на 1% подвижность сперматозоидов и увеличилось на 40% число сперматозоидов с поврежденной акросомой.

Таблица 1. Влияние глубокого замораживания на содержание АТФ в сперматозоидах хряка

Время исследования	Подвижность сперматозоидов, %	Число сперматозоидов с неповрежденной акросомой, %	Содержание АТФ в сперматозоидах, нмоль/10^8кл
До замораживания	83,4±5,0	93,9±4,2	28,1±0,7
Сразу после оттаивания	37,1±1,9	53,2±2,6	16,3±1,1
Через 1 ч после оттаивания	21,8±0,9	45,3±2,7	6,2±0,6
Через 2 ч после оттаивания	18,7±0,7	37,6±1,7	4,9±0,3

Дальнейшая инкубация оттаянных образцов при 37°С способствовала значительному снижению подвижности и содержания АТФ в сперматозоидах. Через 2 часа после оттаивания содержание АТФ в сперматозоидах снизилось в 5,7 раза по сравнению с начальным уровнем (Р<0,01). Следовательно, в процессе замораживания-оттаивания в сперматозоидах хряков происходят значительные деструктивные изменения мембранных структур, в результате чего происходит быстрый гидролиз АТФ под действием содержащихся в клетках и семенной плазме ферментов. Изучение влияния различных способов разбавления спермы хряков перед замораживанием на уровень АТФ в сперматозоидах представлено в таблице 2.

Таблица 2. Влияние способа разбавления спермы перед замораживанием на содержание АТФ в сперматозоидах

Время исследования АТФ	Обычное разбавление		Диализная обработка
	подвижность сперматоз-оидов, %	содержание АТФ, нмоль/10^8кл	подвижность сперматоз-оидов, %	содержание АТФ, нмоль/10^8кл
До замораживания	78,8±4,3	28,2±2,4	80,1±6,8	32,8±2,1
Сразу после оттаивания	31,0±1,2	15,8±1,7	34,1±2,9	19,8±1,2
Через 1 ч после оттаивания	18,6±0,6	5,9±0,3	22,1±1,7	7,7±0,6
Через 2 ч после оттаивания	14,6±1,3	4,7±0,8	22,0±1,8	6,6±0,7

Из таблицы 2 видно, что способ разбавления спермы перед замораживанием оказывает определенное влияние на содержание АТФ в сперматозоидах после замораживания-оттаивания и на их подвижность. Лучшие результаты получены при разбавлении диализным способом. При этом через 2 часа эквилибрации спермы в группе с диализной обработкой было выявлено более высокое удержание АТФ по сравнению с обычным разбавлением: 32,8 нмоль/10⁸ кл. против 28,2 нмоль/10⁸ кл. соответственно. При этом в диализной группе содержание АТФ в сперматозоидах сразу, 1 и 2 часа после оттаивания снизилось на 60,3%, 4,2 и 4,9 раза и против 78,4%, 4,7 и 6,0 раза при обычном разбавлении спермы.

Как видно, также в диализной группе также отмечено менее резкое снижение подвижности оттаянных сперматозоидов. Так после 2 ч оттаивания при обычном разбавлении подвижность сперматозоидов составила 14,6%, а в диализной группе 22,0% или на 7,4% выше.

Эти данные свидетельствуют о том, что диализный метод разбавления спермы хряков способствует более эффективной защите сперматозоидов в процессе их криоконсервации. Вероятно, это объясняется лучшими условиями стабилизации мембранных структур сперматозоидов в процессе эквилибрации. Кроме того, при этом из состава спермы могут удаляться низкомолекулярные компоненты, оказывающие биодеструктивное влияние на мембраны сперматозоидов.

Таким образом, проведенные лабораторные и производственные эксперименты свидетельствуют, что в процессе замораживания-оттаивания в сперматозоидах хряков происходят значительные деструктивные изменения мембранных структур, в результате чего происходит быстрый гидролиз АТФ под действием содержащихся в клетках и семенной плазме ферментов. Эти изменения можно в определенной степени снизить примением диализного метода разбавления спермы перед замораживанием, которая оказывает криозащитное действие на сперматозоидов.

Литература

1. Мороз Л.Г., Корбан Н.В., Шапиев И.Ш. Оценка спермы хряков для замораживания и прогнозирование ее оплодотворяющей способности //Сельскохозяйственная биология.-1982.-Т.17, №3. – С.394-397

2. Прокопцев В.М., Рустенов А.Р. Действие унитиола на сперму хряков //Сельскохозяйственная биология.-1974.-Т.9, №4. – С.581-584

3. Рустенов А.Р. Пути повышения воспроизводства крупного рогатого скота и свиней. Авторефат докт. дисс, 1990. -38 с.

Прослушать

На латинице