Медицина/3. Теоретическая медицина

Бухмин А.В., Россихин В.В., Комбаров Э.Т., Бухмина А.В.

Харьковская медицинская академия последипломного образования

КРИОКОНСЕРВАЦИЯ НА ФОНЕ КРИОПРОТЕКЦИИ: МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ СЕМЕННИКОВ

До настоящего времени не существует универсальных принципов подбора или синтеза криопротектора с заданными, по отношению к биологическому объекту, свойствами.
Цель работы. Выполнить оценку степени жизнеспособности криоконсервированной тестикулярной ткани на фоне криопротекции глицерином и смесью биофлавоноидов.
Материал и этапы исследования. Эксперименты проведены на 10-ти половозрелых беспородных собаках-самцах массой 7-14 кг, содержащихся на обычной диете вивария. Эксперименты на животных выполнены в соответствии с международными требованиями гуманного отношения к экспериментальным животным (адекватный уход, кормление, наркоз, гуманное выведение из опыта). Нами использован гистостереометрический анализ. Семенники помещали в фиксирующую жидкость - 10% нейтральный формалин. Тестикулярную ткань рассекали на пластины во фронтальной плоскости, из которых после обычной парафиновой проводки нарезали серийные срезы и окрашивали гематоксилин - эозином. С помощью винтового окуляр - микрометра МОВ-1-15х, (цена 1 деления при увеличении объектив 40 окуляр 10 составила 0,67 мкм), вмонтированного в тубус светового микроскопа Биолам ЛОМО и окулярной планиметрической сетки, состоящей из 245 тестовых точек, проводили гистостереометрический анализ семенников по следующим параметрам: 1) площадь (S мм²) поперечного сечения канальца; 2) толщина (Т мм) слоя герминативных клеток; 3) индекс сперматогенеза (IS); 4) диаметр (Ǿ мкм), площадь поперечного сечения (S мкм²), объем (V мкм³) ядер герминативных клеток (сперматогонии, сперматоциты, сперматиды), а также клеток Лейдига и Сертоли.

Таблица 1.

Содержание и физико-химические характеристики смеси флавоноидов

Показатели	Исходные данные	После  обработки
Структура	Плотная, в изломе неоднородная	Жидко- сть
Консистенция	Вязкая – при 20-40°, твердая – ниже 20°С	Легкопо- движная
Окисляемость, сек.	21,0	20,0
Масса доли воска, %	23,0	10,3
Масса доли механических примесей, %	18%	Не опреде-ляется
Масса доли флавоноидных  соединений, %	22%	35,6
Йодное число, %	35	38
Кол-во окисляемых в-в в 1 см^3 р-ра окислителя на 1 мг основного в-ва.	0,5	0,4

Находим нужным, привести авторскую пропись (см. авторов) приготовления препарата для криоконсервирования (табл.1): 50 грамм propolis растворяется в 200 мл этилового спирта. После чего раствор пропускается через бумажный фильтр. В полученном растворе вновь растворяется 50 гр. рropolis. В общей сложности, эту процедуру повторяют трижды.
Конечный продукт подвергается выпариванию, а сухой остаток растворяется в дистиллированной воде. В итоге, конечная концентрация флавоноидных и других фенольных соединений, по мнению авторов, возрастает до 36,7%. В этом случае доля воска и количества окисленных веществ уменьшается, а йодного числа остается на прежнем уровне (Т.М. Касымбеков, Ашимов Ж.И., Салибаев О.А., 2007). Полученные результаты и их обсуждение. При морфометрии семенников криоконсервированных на фоне глицерина диаметр и площадь поперечного сечения соответствуют исходным значениям и составляют 0,145+-003 мм и 0,02+-0,0007 мм2. Толщина слоя герминативных клеток по сравнению с нормой снижена в 1,7 раза и составила 0,05+- 0,002 мм. Индекс сперматогенеза был недостоверно выше исходного значения и составил 4,02.
В отношении герминативных клеток следует отметить, что итоговые данные морфометрического исследования сперматогонии, сперматоцитов и сперматид недостоверно отличались от исходных значений. Так, диаметр ядер сперматогонии был равен 4,8+- 0,11 мкм, сперматоцитов - 7,2+- 0,14 мкм, сперматид - 11,05+- 0,6 мкм.
Площадь поперечного сечения ядер сперматогонии составил 18,9+- 0,9 мкм2, сперматоцитов - 41,6+- 1,8 мкм2, сперматид - 11,05+- 0,6 мкм2 . Объем ядер сперматогонии составил 65,1+- 4,7 мкм3, сперматоцитов - 211,2+- 14,8 мкм3, сперматид - 28,9+- 2,6 мкм3 (рис. 4). В целом, такая морфометрическая картина характеризует сохранность сперматогенных клеток под воздействием глицерина по сравнению с группой, где криоконсервация проводилась без криопротектора.
Такая же сохранная морфометрическая картина отмечена и для клеток Сертоли. Диаметр ядер этих клеток составил значение близкое к исходному - 6,1+- 0,09 мкм. Площадь поперечного сечения ядер равна 30,7+- 1,0 мкм2, а объем ядер клеток составил 132,8+- 6,7 мкм3. Напротив, для клеток Лейдига было характерно недостоверное повышение изучаемых показателей. Так, диаметр ядер составил 5,9+- 0,1 мкм. Площадь поперечного сечения ядер равнялась 28,5+- 1,3 мкм2, а объем ядер - 118,7+-8,5 мкм3.
Таким образом, в данной группе исследований можно утверждать о сохранности структурных компонентов тестикулярного трансплантата от криогенных повреждений при использовании в качестве криопротектора 10% раствора глицерина.
При использовании в качестве криопротектора смеси биофлавоноидов морфометрические показатели состояния семенных канальцев были следующими: диаметр канальца был равен 0,16+-0,0016 мм, а площадь поперечного сечения канальца равнялась 0,02+-0,0004 мм2, что не достоверно отличало эти показатели от значений исходной величины и при использовании раствора глицерина.
Однако, в отличие от сравниваемых групп толщина слоя герминативных клеток была достоверно меньше в случае с нормой и составила 0,037 0,011 мм. Индекс сперматогенеза был также снижен и составил 3,13.
При исследовании сперматогенных клеток количественные показатели в данной группе не достоверно отличались от данных, где применялся глицерин. Для сперматогонии диаметр ядер составил 4,9+- 0,06 мкм, сперматоцитов - 6,7+- 0,07 мкм и сперматид - 3,8+-0,06 мкм. Площадь поперечного сечения сперматогонии составила 19,5+-0,6 мкм2, сперматоцитов - 35,6+-0,8 мкм2, сперматид - 11,6+-0,3 мкм2 .
Объем ядер сперматогонии был равен 68,05+- 2,9 мкм3, сперматоцитов - 163,2+- 5,8 мкм3, сперматид - 21,5+- 1,3 мкм3 . Количественные показатели поддерживающих клеток Сертоли были выше значений опытной группы, где применялся глицерин, и соответствовали исходным значениям. Так, диаметр ядер был равен 6,6+- 0,07 мкм, площадь поперечного сечения составила 35,1+- 0,7 мкм2, а объем ядер клеток - 159,4+-5,1 мкм3.
Вывод. Использование в качестве криопротектора смеси биофлавоноидов позволяет достигнуть сохранности структурных образований семенника, не уступающей апробированному криопротектору глицерину. В частности, интерстициальный отек выражен в меньшей степени, чем при криопротекции глицерином. Примечательно то, что при использовании указанного криопротектора зрелые сперматозоиды встречаются во всех канальцах, в достаточном количестве и с сохраненной центробежной ориентацией.