Медицина/12. Инфекционные болезни (Инфектология).

Тимофеева А.В.³, Галатенко О.А.¹, Ильина М.В.², Терехова Л.П.¹, Катруха Г.С.¹

¹ ФГБУ НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе РАМН,

г. Москва, Россия.

²Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева,

г. Москва, Россия.

³НИИ ФХБ им. А.Н.Белозерского, МГУ, г. Москва, Россия

Получение и исследование антимикробной активности комплексов типа «антибиотик-нанотрубки»

(«Таунит»-антибиотик).

В настоящее время инфекционные заболевания продолжают оставаться одной из наиболее серьезных проблем здравоохранения во всем мире. Бесконтрольная и не всегда целесообразная терапия антибиотиками привела к развитию множественной лекарственной резистентности бактерий к антимикробным препаратам. Решить эту проблему пытаются как путем поиска новых природных антибиотиков, так и с помощью химической модификации известных антибиотиков и синтеза новых синтетических лекарственных средств. Однако, на сегодняшний день известно, что даже новые, современные препараты не могут полностью устранить резистентность бактериальных патогенов к антибиотикам. Попытки увеличивать дозу назначаемых антибиотиков приводят к увеличению токсичности и, как следствие, к развитию побочных эффектов у больных.

Выход из создавшейся ситуации возможен при целенаправленной разработке и создании новых, эффективных препаратов, которыми, в частности, могут стать «наноантибиотики» - наноматериалы, предназначенные для борьбы с инфекционными заболеваниями. Такие наноматериалы проявляют антимикробную активность либо самостоятельно, либо, если материал неактивен, в комплексе с антимикробным агентом (антибиотиком) [1].

В настоящей работе в качестве наноматериала для создания «наноантибиотика» мы решили использовать многостенные нанотрубы (МУНТ) типа «Таунит» [2] (Рис.1). Сами нанотрубы типа «Таунит» не обладают ни антимикробной, ни антифунгальной активностью и поэтому мы считаем, что «Таунит» целесообразно применять для борьбы с патогенной микрофлорой в виде комплексов с антибиотиками. Для работы были выбраны известные и практически важные антибиотики: гризеовиридин и этамицин А (активные в отношении Staphylococcus aureus (MRSA), полимиксин В (активный в отношении Escherichia сoli) и нистатин, обладающий высокой активностью в отношении микромицетов и, в частности, Aspergillus niger [3].

Рис.1 Электронная сканирующая микроскопия многостенных углеродных нанотруб типа «Таунит» [2]. Репер в правом нижнем углу имеет размер 1 мкм.

Иммобилизацию антибиотиков на «Таунит» проводили в статических условиях путем добавления к навеске (5,0 мг) сорбента «Таунит» 600 мкл водного раствора антибиотиков с концентрацией 0,2 мг/мл. Антибиотики гризеовиридин и этамицин А смешивали в массовом соотношении 1:1, в результате концентрация каждого антибиотика в растворе равнялась 0,2 мг/мл. Суспензии «Таунит»-антибиотик выдерживали в течение 18 час. при 18-20⁰С. По окончании сорбции раствор антибиотика отделяли от сорбента центрифугированием на микроцентрифуге фирмы BECKMAN COULTER ™ Microfuge® 18 Centrifuge (США) в течение 5-7 мин. при 11894g. Количество антибиотиков в растворе до сорбции и после сорбции определяли методом обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) на микроколоночном хроматографе Милихром А-02”(ЗАО «Эконова», г. Новосибирск, Россия) [4] с колонками из нержавеющей стали размером (2.0×75,0 мм), заполненными сорбентом Nucleosil 100-5C18 РАН фирмы «Macherey-Nagel» (Германия). Колонки термостатированы при 35°С. Реагенты готовили, используя воду высшей степени очистки (18.1 Мом/см), полученную на установке Milli-Q®Plus «Millipore» (Франция); ацетонитрил для ВЭЖХ фирмы «Sigma-Aldrich» (Германия). Для анализа готовили растворы антибиотиков в воде с концентрацией 0,2 – 3,0 мг/мл. Объем вводимой пробы составлял 5-15 мкл. Детекцию разделяемых веществ осуществляли при двух длинах волн - 214 и 280 нм. Время ОФ ВЭЖХ анализа - 25 мин. для каждого из анализируемых препаратов антибиотиков. В работе использовали линейный градиент подвижной фазы, создаваемый элюентом А (0.1% раствор трифторуксусной кислот (ТФУ) в воде) и элюентом В (0.1% раствор ТФУ в ацетонитриле). Полученные хроматограммы оценивали с помощью компьютерной программы МультиХром–СПЕКТР для Windows 9х &NT версия 1,5х-Е («Амперсенд», Россия).

В ходе исследования было установлено, что в разработанных нами условиях выбранные антибиотики этамицин А, гризеовиридин, полимиксин В и нистатин полностью адсорбируются на «Тауните», образуя прочные комплексы [5]. При испытании полученных комплексов в опытах in vitro методом биоавтографии на агаровых пластинах [6], содержащих чувствительные к указанным антибиотикам тест-организмы, было установлено, что комплексы «Таунит»-(гризеовиридин+этамицин А) высоко активны в отношении метициллин-резистентного Staphylococcus aureus (MRSA); комплекс «Таунит»-нистатин проявляет антифунгальную активность в отношении Aspergillus niger, а комплекс «Таунит»-полимиксин В практически не подавляет рост Escherichia сoli (таблица 1).

Таблица 1. Антибактериальная активность комплексов «Таунит»-антибиотик.

№п/п	Комплекс	Тест-организм	Антибактериальная/антифугаль-ная активность комплекса (диаметр зоны подавления роста, мм)
1	«Таунит»-(гризеовиридин+этамицин А)	Staphylococcus aureus (MRSA)	30±0.2
2	«Таунит»-полимиксин В	Escherichia сoli	нет активности
3	«Таунит»-нистатин	Aspergillus niger	14±0.2

Возможно, что отсутствие антимикробной активности у комплекса «Таунит»-полимиксин В связано с тем, что полимиксины воздействуют на цитоплазматическую мембрану бактериальной клетки (в нашем случае Escherichia сoli), взаимодействуя с фосфолипидами мембраны. Они связываются посредством NH₂-групп, входящих в состав молекулы полимиксина В с анионными участками мембраны, конкретно, с остатками карбоксильных групп и, таким образом, повреждают структуру мембраны. В результате происходит изменения проницаемости мембраны как для внутри-, так и для внеклеточных компонентов, что вызывает гибель клетки [7]. Мы предполагаем, что адсорбция полимиксина В на нанотрубы проходит, в том числе, и посредством взаимодействия NH₂-групп антибиотика с остатками СООH-групп, расположенных на поверхности (торцах) трубок [8]. NH₂-группы антибиотика, оказавшись связанными прочными ионными связями с СООH-группами нанотруб, не могут вступить во взаимодействие с анионными участками клеточной мембраны, и поэтому комплекс «Таунит»- полимиксин В оказывается неактивным.

Для комплексов «Таунит»-(грзеовиридин+этамицин А), обладающих высокой антимикробной активностью в отношении MRSA, было проведено изучение их антимикробной активности при различной количественной нагрузке «Таунита» антибиотиками. Из литературных данных известно, что такие исследования проводят путем сравнения активности комплекса с активностью «чистого» антибиотика, используя метод лунок [9]. Нам представляется такое сравнение не совсем корректным, поскольку сравниваются разные (по агрегатному состоянию) смеси, а именно, гомогенный раствор «чистого» антибиотика с гетерогенной суспензией комплекса сорбент–антибиотик. Поэтому мы проводили исследования, сравнивая антимикробную активность комплексов «Таунит»-антибиотик с комплексами антибиотик-активированный уголь (АУ) полученными в результате иммобилизации антибиотиков на известный уголь - Darco G-60, particle size 18µm (USA). Для этого на 5 мг сорбентов («Таунита» и АУ) была иммобилизована смесь антибиотиков (гризеовиридин+этамицин А) в следующих количествах: точка 1 на чашке Петри – 120 мкг+120 мкг, точка 2 – 60 мкг+60 мкг, точка 3 – 30 мкг+30 мкг, точка 4. – 15 мкг+15 мкг (методику см. выше). Полноту сорбции определяли с помощью ОФ-ВЭЖХ анализа по методике, представленной выше. Было установлено, что при любой количественной нагрузке антибиотики полностью адсорбируются как на «Таунит», так и на АУ. Результаты антимикробной активности полученных комплексов представлены на рис. 3, и таблице 2. Из рисунка и таблицы следует, что антимикробная активность комплекса «Таунит»-(гризеовиридин+этамицин А) значительно выше, чем активность комплекса АУ-(гризеовиридин+этамицин А). Так, например, при использовании комплексов с максимальным количеством иммобилизованных антибиотиков (120+120 мкг, соответственно) диаметр зоны подавления роста у комплекса «Таунит»- (гризеовиридин+этамицин А) равен 30±0,2 мм, а у АУ - (гризеовиридин+этамицин А) - 13±0,2 мм. При нагрузке сорбентов антибиотиками в количестве 15 мкг+15 мкг, соответственно, диаметр зоны подавления роста у комплекса «Таунит»-(гризеовиридин+этамицин А) - 30±0,2 мм, а для комплекса АУ-(гризеовиридин+этамицин А) – следы (ободок). Поэтому для «Таунита» были проведены опыты по иммобилизации на сорбент еще меньших количеств антибиотиков, а именно точка 5 - 7,5 мкг+7,5 мкг, точка 6 - 3,75 мкг+3,75 мкг, точка 7 -1,87 мкг+1,87 мкг (см. рис.4 Таблица 2). Полученные результаты свидетельствуют о том, что даже при адсорбции минимального количества антибиотиков на «Таунит» (1,87 мкг+1,87 мкг), комплекс «Таунит»-(гризеовиридин+этамицин А) проявляет антимикробную активность в отношении MRSA (диаметр зоны роста 9±0,2 мм) (см. рис. 4, Таблица 2), тогда как комплекс АУ - (гризеовиридин+этамицин А) практически неактивен уже при нагрузке на АУ антибиотиками в количестве (15 мкг+15 мкг) (см. рис.3, Таблица 2).

Рис.3

Антимикробная активность комплексов «Таунит»-(гризеовиридин+этамицин А) и АУ-(гризеовиридин+этамицин А) в отношении S. aureus (MRSA) при разной количественной нагрузке антибиотиков на сорбент. Верх (над чертой): комплексы «Таунит»-антибиотики. Низ (под чертой): комплексы АУ-антибиотики (на рисунке точки 1-4 расположены справа налево)

Таблица 2. Антимикробная активность комплекса «Таунит»-(гризеовиридин+этамицин А) и АУ-(гризеовиридин+этамицин А) в зависимости от количества иммобилизованных антибиотиков на «Тауните».

№п/п	Количество антибиотиков (гризеовиридина+этамицина А), иммобилизованных на «Таунит» и АУ, мкг	Антимикробная активность комплексов в отношении Staphylococcus aureus (MRSA)
		«Таунит»- гризеовиридин +этамицин А	АУ-гризеовиридин +этамицин А
		Диаметр зоны подавления роста, мм
1.	120+120	30±0,2	13±0,2
2.	60+60	30±0,2	11±0,2
3.	30+30	30±0,2	7-9±0,2
4.	15+15	30±0,2	Обод (н/а)
5.	7,5+7,5	20±0,2	-
6.	3,75+3,75	12±0,2	-
7.	1,87+1,87	9±0,2	-

Рис.4

Антимикробная активность комплексов «Таунит»- (гризеоиридин+этамицин А) в отношении S. aureus (MRSA) с различной количественной нагрузкой антибиотиков на трубы. (на рисунке в верхнем ряду справа налево расположены точки 1-3, в среднем - точки 4-6, в нижнем - точка 7).

Для интерпретации полученных результатов мы предлагаем следующие объяснение. Ранее нами опытным путем было показано, что антибиотики гризеовиридин и этамицин А образуют очень прочный комплекс с твердой матрицей «Таунита» [5]. Вероятно поэтому сами антибиотики не могут диффундировать в агар, а диффузия осуществляется путем (за счет) проникновения целиком комплекса «Таунит»-антибиотик через микропоры, существующие в агаре, и именно этот комплекс вызывает подавление роста тест-организма на агаровом блоке. Возможно, по такому же принципу проявляет антимикробную активность комплекс АУ-антибиотик, но поскольку размер частиц сорбента «Таунит» меньше (40 нм), чем размер частиц АУ (18 µm), комплексу АУ-антибиотик сложнее диффундировать в агар. Поэтому антибактериальная активность комплексов «Таунит»- антибиотик существенно больше, чем комплексов АУ- антибиотик. Мы также предполагаем, что антимикробная активность комплексов зависит как от способа иммобилизации антибиотика на сорбент, так и от размера и формы поверхности сорбента-носителя. В работе мы использовали «Таунит» в форме «матрешка» [10] (рис.5), на которую, как известно, антибиотики адсорбируются на поверхности материала [2]. В то же время иммобилизация веществ на АУ проходит, в основном, посредством проникновения в глубь пор, имеющихся в огромных количествах у активированных углей [11]. Поэтому антибиотик, иммобилизованный на «Тауните», может достаточно свободно контактировать с клеточной стенкой бактерией, а сорбированный на АУ - становится недоступным для взаимодействия (контакта) с бактериальной клеткой.

Рис.5 Многостенные углеродные нанотрубы в форме «матрешка»

Результаты проведенного исследования дают основание для более детального исследования антифугальной активности полученных комплексов «Таунит»-нистатин как в отношении A. niger, так и других штаммов низших грибов; поиска антибиотиков, которые в комплексе с «Таунитом» смогут проявлять высокую антимикробную активность в отношении E. сoli, а также более широкого исследования комплексов «Таунита» с другими известными и практически важными антибиотиками, чтобы, в перспективе, использовать комплексы типа «Таунит»-антибиотик в клинической практике в качестве «наноантибиотиков».

Литература:

1. Ae Jung Huh , Young Jik Kwon “Nanoantibiotics”: A new paradigm for treating infectious diseases using nanomaterials in the antibiotics resistant era. J. of Controlled Release.- 2011.- V.156- PP. 128–145

2. Мищенко С.В. Углеродные наноматериалы. Производство, свойства, применение. /Мищенко С.В., А.Г. Ткачев. // М. Машиностроение. – 2008. – № 2. – С. 17 – 21.

3. The Merck Index. An encyclopedia of chemicals, drugs, and biological. Tenth edition. Martha Windholz, Editor. Published by Merck & Co., Inc. Rahway, N.Y., U.S.A., 1983

4. ЭкоНова: HI-TECH в аналитическом приборостроении. // Technopolis XXI.- 2005.-№ 2 (www.econova.ru).

5. Тимофеева А.В. Исследования процессов сорбции и десорбции антибиотиков разных групп на многослойных углеродных нанотрубках типа «Таунит». /Тимофеева А.В., Ильина М.В., Сапурина И.Ю., Баратова Л.А., Катруха Г.С. // IX Международная научно-практическая конференция «Современные научные достижения-2013» 27.01.2013-05.02.2013г. (статья будет напечатана в сборнике Publishing House «Education and Science» s.r.o (Czech Republic, Prague))

6. Haese A. Genetics of Actinomycin C Production in Streptomyces chrysomallus. Haese A., Keller U. // J. Bacteriol.- 1988. - V. 170 (3).- P. 1360-1368.

7. Щетинин Е.В. Полимиксины - новый взгляд на известные антибиотики. // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. -2000.- Т.2.-№3- с.68-72.

8. Раков Э.Г. Химия и применение углеродных нанотрубок // Успехи химии. – 2001. – Т. 70, № 10. – С. 939

9. G. L. Burygin, B. N. Khlebtsov , A. N. Shantrokha , L. A. Dykman, V. A. Bogatyrev , N. G. Khlebtsov. On the Enhanced Antibacterial Activity of Antibiotics Mixed with Gold Nanoparticles // Nanoscale Res. Lett. -2009. – V. 4. PP. 794–801.

10. Еременко А.С. Исследование углеродных волокон и углеродных нанотрубок. / Еременко А.С., Власов А.И. // Двенадцатая научная конференция «Шаг в будущее- Москва, 2009» Доклады на тематической секции кафедры ИУ4 МГТУ им. Н.Э Баумана.– 2009. (IU4.BMSTU.RU)

11. Водоподготовка: справочник (Под редакцией Беликова С.Е. М: Аква-Терм. -2007.-С. 240.