Биологические науки/6 Микробиология

 

К.б.н. Яковлева М.Б., д.б.н. Никитина З.К., к.б.н. Савина Т.А., к.б.н. Савин П.С.

Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений, Москва, Россия

Секреция протеиназ и коллагеназ Aspergillus flavus в условиях культивирования в ферментерах

 

     В настоящее время для получения антибиотиков, аминокислот, гормонов, ферментов используются микроорганизмы, которые  могут обеспечить бесперебойный процесс культивирования. Для этих целей применяются ферментёры различного объёма. Масштабирование производства позволяет значительно удешевить конечный продукт, снизить энергозатраты, обеспечить большую доступность исходного сырья. Изучение различных ферментов, синтезируемых микроорганизмами, и возможности их практического применения является одним из актуальных направлений биотехнологии. К числу таких ферментов относятся протеиназы и коллагеназы, входящие в состав лекарственных средств, используемых для удаления рубцов, келоидов, при лечении ожогов и язв [1].

      При проведении поиска продуцентов с коллагенолитической активностью среди дейтеромицетов коллекции ГНУ ВИЛАР и подбора условий их хранения [2, 3], был выявлен наиболее продуктивный и устойчивый штамм Aspergillus flavus. В лабораторных условиях в колбах на качалках указанный дейтеромицет синтезировал две протеиназы, способные гидролизовать коллаген [4, 5]. Цель настоящего исследования заключалась в масштабировании процесса получения протеолитических и коллагенолитических ферментов с использованием дейтеромицета Aspergillus flavus для получения новых лекарственных средств на их основе. Для достижения указанной задачи культивирование Aspergillus flavus проводили в ферментерах с несколько различными конструктивными особенностями.

     Объектом исследования служил дейтеромицет Aspergillus flavus. В качестве посевного материала использовали семисуточную суспензию спор, выращенную при 260С на агаризованной среде Чапека. Глубинное культивирование Aspergillus flavus проводили в ферментёрах объемом 2,7 л с 1 л модифицированной питательной среды Чапека, содержащей 0,5% сахарозы и 1,5% коллагена. Отличие ферментёров заключалось в конструкции турбинных 6-ти лопастных мешалок.

    Содержание белка в фильтрате культуральной жидкости анализировали методом Лоури [6]. Определение общей протеиназной активности (ПЕ/мл) анализировали по методу Ансона в модификации Nomoto Narashashi [7] Удельную протеолитическую активность рассчитывали как отношение ПЕ на мг белка. Удельную коллагенолитическую активность определяли ранее разработанным нами методом [4].

     Глубинное культивирование Aspergillus flavus проводили в двух ферментерах, отличающихся расположением лопастей у мешалок, которое приводило к различию коэффициентов массопередачи (21 ч-1 для ферментёра №1, и 30 ч-1 для ферментёра №2). Динамику роста микромицета оценивали на основании изменений морфологических признаков и потребления сахарозы из состава питательной среды. В первые 18 час роста споры микромицета начинали прорастать, образуя нити мицелия, которые позднее собирались в клубки – пеллеты. В первом ферментёре пеллеты были крупнее, по сравнению с теми же в ферментёре №2.

    Установлено, что через 18 час культивирования в первом ферментёре использовалось около 70% сахарозы от первоначального количества, а во втором ферментёре – 80%. Начиная с 18 час и до 66 час роста культуры, наблюдалось дальнейшее снижение количества остаточной сахарозы в первом ферментёре, которая к 66 час полностью исчерпывалась. Во втором ферментере полное использование углевода происходило уже к 42 часу. Таким образом, в первом ферментёре потребление сахарозы проходило медленнее, по сравнению со вторым, что связано, вероятно, с разницей в коэффициентах массопередачи.

     В процессе культивирования дейтеромицета наблюдалось накопление внеклеточного белка, причем во втором ферментере на более ранних сроках, что коррелировало и со скоростью поглощения сахарозы культурой Aspergillus flavus. Эти различия также, вероятно, связаны с разницей в конструкции мешалок в ферментерах.

    Выявлено, что протеолитическая активность культуральной жидкости нарастала постепенно по мере использования коллагена в процессе ферментации, достигая максимума к 48 (ферментер №1) и 66 часам (ферментер №2), а затем снижалась. Аналогичным образом менялась и удельная протеиназная активность. При этом максимальная удельная протеолитическая активность к 42 часу во втором ферментере была приблизительно равна удельной протеолитической активности в первом ферментёре к 48 часу.

     Проведенные исследования показали, что секретируемые Aspergillus flavus протеиназы обладали коллагеназной активностью (табл. 1). При этом коллагенолитическая активность культуральной жидкости, полученной в ферментерах, была сравнима с таковой при культивировании в колбах на качалке. Однако время ферментации, необходимое для секреции энзимов, значительно сокращалось при использовании ферментеров

Таблица 1

Коллагенолитическая активность при глубинном  культивировании Aspergillus flavus в колбах и ферментёрах

Способ культивирования

Время культивирования, ч

Удельная коллагенолитическая

активность

В колбах на качалке

168

0,83±0,05

Ферментер № 1

48

0,68±0,06

Ферментер № 2

42

0,71±0,06

     Таким образом, в результате проведенных исследований показана возможность масштабирования процесса культивирования Aspergillus flavus - продуцента протеолитических ферментов с использованием ферментеров. Обнаружено, что конструктивные особенности используемых  биореакторов являлись факторами экзогенной регуляции и влияли на такие параметры, как: скорость потребления сахарозы, секреция внеклеточного белка, накопление протеолитических ферментов в культуральной жидкости, время ферментации. Показано, что секретируемые протеиназы обладали коллагенолитической активностью.

 

Литература

7. Бондарев С.В. Применение препаратов коллагеназ для лечения ран и рубцов кожи //Дисс.канд мед. наук. С-Петербург 2008. С. 125.

8. Захарова Е.А., Яковлева М.Б., Никитина З.К., Быков В.А.  Коллагенолитические ферменты, синтезируемые некоторыми видами микроорганизмов // Биомедицинские технологии 1998. В. 10, С. 29-32

9. Яковлева М.Б., Хоанг Т.Л. Никитина З.К. Коллагенолитическая активность у некоторых видов дейтеромицетов при различных методах хранения // Прикл . биохимия и микробиол. 2006., Т. 42, № 4. С. 489-492

10.Сухосырова Е.А., Яковлева М.Б., Никитина З.К., Быков В.А. Секреция коллагенолитических ферментов некоторыми видами дейтеромицетов. //Технологии живых систем 2007.В. 24. С. 302-310.

11.Сухосырова Е.А., Никитина З.К., Яковлева М.Б. Выделение, очистка и некоторые свойства коллагенолитических ферментов, секретируемых Aspergillus flavus. //Вопросы биологич., медицин. и фармацевтич. химии 2008 №2 С.46-49.

13 .H.Lowri, N.J.Rosebrough, A.L.Farr, Protein measurement with the Folin reagent. //J. Biol.Chem.1954.  193 (1). 265-274

14.Nomoto M., Narashashi Y. A proteolytic enzyme of Streptomyces griseus 1. Purification of a protease of Streptomyces griseus. //J. Biocem. 1959. V. 45. № 4 P.653-656.