О.И. Гулий*, Б.Д. Зайцев**, И.Е. Кузнецова**, А.М. Шихабудинов**, А.А.Теплых**, Л.Ю. Матора*, О.А. Караваева, С.А. Павлий*, О.В. Игнатов*

 

* - Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук, 410049 г. Саратов, проспект Энтузиастов, 13

** - Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт радиотехники и электроники им. В.А. Котельникова Российской академии наук, Саратовский филиал, 410019 г. Саратов, ул. Зеленая, 38

 

Использование электроакустического датчика для изучения взаимодействия микробных клеток с поликлональными антителами

 

Одной из проблем современной микробиологии является изучение взаимодействия антител с поверхностью микробной клетки с целью создания чувствительных сенсорных систем для детектирования различных видов микроорганизмов [1-3]. Особый интерес вызывают акустические методы исследования, которые отличаются высокой чувствительностью и возможностью проводить анализ в реальном времени. В этом плане весьма перспективными оказались пьезоэлектрические резонаторы с поперечным возбуждающим электрическим полем, которые в отличие от традиционных резонаторов с продольным полем более чувствительны к изменению параметров контактирующей жидкости, поскольку реагируют на изменение как механических, так и электрических ее свойств. Ранее была показана возможность детекции микробных клеток Escherichia coli O157:H7 в суспензии при нанесении на поверхность пьезоэлектрического резонатора пленки, иммобилизующей соответствующие антитела [4]. Показана возможность использования акустических сенсоров для детекции Salmonella typhimurium [5] и Escherichia coli [6] с применением бактериофагов.

Целью работы являлось исследование возможности анализа взаимодействия микробных клеток с антителами с помощью резонатора с поперечным электрическим полем на примере Azospirillum brasilense Sp7.

(а)
 

(б)
 
Для этого были получены специфические поликлональные кроличьи антитела на эпитопы О-антигенов штамма A. brasilense Sp7 и показана возможность их применения для детекции микробных клеток с помощью пьезоэлектрического резонатора с поперечным электрическим полем. Установлено, что частотные зависимости реальной и мнимой частей электрического импеданса такого резонатора, нагруженного суспензией клеток A. brasilense Sp7 с антителами, значительно отличаются от зависимостей резонатора с контрольной суспензией клеток без антител. На рис. 1 представлены зависимости изменения реальной (а) и мнимой (б) значений частей импеданса в результате взаимодействия клеток с антителами от концентрации клеток для частоты 6.74 МГц. Видно, что в диапазоне 102 - 104 кл/мл аналитический сигнал от концентрации не зависит, но зато взаимно-однозначное соответствие между аналитическим сигналом и концентрацией существует в интервале 104 – 108 кл/мл. Таким образом, анализ показывает возможность детекции клеток при использовании специфических антител, и при этом нижний предел детекции составляет 104 кл/мл.

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 1. Зависимости изменения значений реальной (А) и мнимой (В) частей электрического импеданса датчика суспензии клеток A. brasilense Sp7 от концентрации клеток при добавлении антител для частоты 6.74 МГц.

С помощью электронной микроскопии показано, что полученные антитела взаимодействуют с клетками азоспириллы, причем скопление маркера происходит по всей поверхности клетки (рис. 2).

 

 

 

 

 

 

 


Рис. 2. Электронно-микроскопическое изображение бактерий A. brasilense Sp7, меченных конъюгатом протеина А с коллоидным золотом после взаимодействия клеток с антителами (увеличение 10 000).

 

Таким образом, установлено, что частотные зависимости реальной и мнимой частей импеданса резонатора, при внесении в суспензию клеток специфических антител, конъюгированных с клетками, значительно отличаются от указанных зависимостей резонатора с контрольной суспензией клеток без антител. Этот результат показывает возможность использования в качестве аналитического сигнала значение действительной или мнимой части электрического импеданса на фиксированной частоте вблизи резонанса. Определен нижний предел возможного определения микробных клеток, который составляет ~104 кл/мл при их взаимодействии с антителами. Детекция клеток A. brasilense Sp7 с использованием специфичных антител возможна и в присутствии в суспензии посторонней микрофлоры, напр. клеток E.coli BL-Ril.

Поскольку результаты электроакустического анализа хорошо согласуются с результатами электронной микроскопии, мы считаем, что представленные результаты показывают возможность создания биологического акустического датчика для количественного анализа микробных клеток с нижним пределом детекции ~104 клеток/мл. Пьезоэлектрический резонатор с поперечным электрическим полем для детекции микробных клеток при их взаимодействии со специфическими антителами, принципиально отличается от описанных способов определения микробных клеток при помощи биосенсорных систем с использованием иммобилизованных антител [4] и бактериофагов [5] простотой выполнения процедуры анализа, достаточной чувствительностью и быстротой получения результата.

Представленные результаты демонстрируют возможность регистрации взаимодействия микробных клеток с антителами и разработки биологического датчика для количественной оценки концентрации микробных клеток.

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бунин В.Д., Игнатов О.В., Гулий О.И., Волошин А.Г., Дыкман Л.А., О’Нейл Д., Ивницкий Д. Исследование электрофизических свойств клеток Listeria monocytogenes при взаимодействии с моноклональными антителами // Биофизика. 2005. Т.50. Вып.2. С.316-321.

2. Guliy O.I., Matora L.Yu., Burygin G.L., Dykman L.A., Ostudin N.A., Bunin V.D., Ignatov V.V., Ignatov O.V. Electrophysical characteristics of Azospirillum brasilense Sр245 during interaction with antibodies to various cell-surface epitopes // Analytical Biochemistry. 2007. V. 370. P. 201-205.

3. Jyoung J.Y., Hong S., Lee W., Choi J.W. Immunosensor for the detection of Vibrio cholerae O1 using surface plasmon resonance // Biosens. Bioelectron. 2006.V. 21. № 12. P. 2315-2319.

4. Vetelino J.F. A lateral field excited acoustic wave sensor platform. Proceed of IEEE Ultrason. Symp, San-Diego. 2010.

5. Handa H., Gurczynski S., Jackson M. P., Auner G., and Mao G. Recognition of Salmonella Typhimurium by Immobilized Phage P22 Monolayers. // Surf Sci. 2008. V.602. Iss.7. P. 1392–1400.

6. Zaitsev B.D., Kuznetsova I.E., Shikhabudinov A.M., Ignatov O.V., Guliy O.I. Biological sensor based on the lateral electric field excited resonator // IEEE Transections on Ultrasonics, Ferroelectrics and Frequency Control.  May.2012. Vol. 59. N. 5. P.963-969.