Лутик И.Л.¹,Дубатовка Е.И.², Адзерихо И.Э.¹

Белорусская медицинская академия последипломного образования¹

ГНУ «Институт химии новых материалов НАН Беларуси»²

Оценка влияния различных параметров ультразвука на размер пектинатных микросфер in vitro

Введение (цели/задачи)

Ультразвуковое воздействие на тромб относится к перспективным методам тромборазрушения. В настоящее время накоплен значительный преклинический и клинический материал, свидетельствующий о высокой эффективности использования внутрисосудистого высокоинтенсивного ультразвука (УЗ) для разрушения сосудистых тромбов как в чистом виде [1], так и в сочетании с тромболитическими препаратами [2]. При этом показана зависимость степени тромборазрушения от параметров УЗ. В последние годы нами установлена также связь степени разрушения тромба от формы головки волновода [3].

В настоящее время особый интерес вызывают результаты экспериментальных исследований, в которых показано, что УЗ воздействие в сочетании с эхоконтрастными препаратами значительно увеличивает степень тромборазрушения. Установлено, что механизм данного разрушения, в основном, связан со снижением порога кавитации [4].

Несмотря на успешные результаты in vitro и in vivo использования эхоконтрастных веществ в сочетании с УЗ, до настоящего времени отсутствуют результаты их клинического применения. Отчасти, это связано с их высокой стоимостью, а также отсутствием стабильно высокой степени разрушения тромба.

Ранее нами получены в экспериментальных условиях микросферы, представляющие собой диспергированную смесь полимера пектина, желированную эмульсией хлорида кальция.

Целью нашего исследования было изучение влияния на размер пектинатных микросфер низкочастотного ультразвука различной скважности, интенсивности, продолжительности воздействия в условиях применения различных форм головки волновода in vitro.

Материалы и методы

Для получения пектинатных микросфер 1 г 1,5 – 3 % раствора пектина диспергировали в 8 г изооктана, содержащего 1,8 мг сорбитанамоноолеата (Спан 80), 1,8 мг полиоксиэтиленсорбитанатриолеата (Твин 85), затем подвергали обработке низкочастотным УЗ (22 кГц) в течение 2 минут. После этого смесь желировали эмульсией хлорида кальция (1,2 – 5,9 % v/v), также содержащей поверхностно-активные вещества. Полученные микросферы отмывали изооктаном и лиофилизировали. Растворение лиофилизированныхпектинатных микросфер проводили в изотоническом растворе натрия хлорида из расчета 1 мл частиц на 1 мл раствора. Все исследования проводились в стандартных пластиковых пробирках объемом 2 мл.

Обработку импульсным ультразвуком (УЗ) суспензии пектинатных микросфер проводили при помощи установки для акустоиндуцированноготромболизиса (РНПЦ «Кардиология», технопарк БНТУ «Политехник», Беларусь), состоящей из генератора и волноводов. В работе использовали следующие параметры ультразвука: рабочая частота генератора - 23500 Гц, скважность – 30% и 45%, интенсивность - 16,2, 25,1 и 46,2 Вт/см², время озвучивания - 60, 90, 120 и 180 секунд. Для экспериментов применяли два типа волноводов, изготовленных из стали марки 12X18Н10, имеющих диаметр 2 мм, длину 23,5 см с двумя формами головок: плоской с отверстием (П) и шаровидной без отверстия (Ш). В течение всего времени УЗ обработки осуществляли температурный контроль с помощью электронного контактного термометра ЛТ-300 (Аналитприбор, Россия). В результате разница между образцами до и после озвучивания составила 0,2º.

Результаты УЗ воздействия оценивали до и после озвучивания, а также через 20 минут наблюдения путем микроскопической оценки размеров микрочастиц в каждой пробе. Для этого использовали микроскоп МЛ-3 (Россия) с камерой Горяева, на сетку которого наносили каждый образец суспензии с микрочастицами. Исследование проводили при увеличении х400. Анализ изменения размера микрочастиц в поле кавитации проводили путем оценки не менее трех полей зрения. Расчет размера полученных частиц проводили на основании следующих характеристик камеры Горяева: сторона малого квадрата - 0,05 мм, сторона большого квадрата 0,2 мм. Количество проб для каждой группы экспериментов составило n=10.

Результаты обрабатывали с использованием программного пакета MicrosoftExcel 2003, STATISTICA 6.0 (Version 6-Index, StatSoftInc., США). Достоверными считали различия в уровне доверительной вероятности р<0,05.

Результаты

Установлено, что суспензия пектинатных микросфер исходно состоит преимущественно из мелких микросфер диаметром 1 – 5 мкм с общей долей 85 ± 5%. В тоже время, в 12±4% были выявлены частицы размером 6 – 20 мкм, в 2± 1% - конгломераты частиц, размером более 20 мкм в диаметре.

Воздействие УЗ с использованием двух типов головок на суспендированные растворы пектинатных микросфер (ПМ) приводило к достоверному уменьшению их размера (p<0,05) по сравнению с исходным значением. Степень диспергирования микрочастиц имела прямую зависимость от интенсивности и продолжительности и не зависела от скважности.

Существенные различия в степени разрушения ПМ были отмечены также при различных типах формы головки волновода (рис. 1). Так, использование ШГ волновода при одинаковой интенсивности и продолжительности воздействия УЗ способствовало более высокой степени диспергирования по сравнению с волноводом ПГ. Максимальная степень диспергирования выявлена в случае использования ШГ при уровне интенсивности 46,2 Вт/см² и скважности 45%. При этом доля частиц диаметром менее 5 мкм увеличивалась по сравнению с исходным состоянием до 90% ± 3 (p<0,05).

Рис.1. Динамика числа пектинатных микросфер объемом 1 мл, растворенных в 1 мл 0,15М изотонического хлорида натрия, при воздействии НЧ УЗ различной интенсивности, скважности и времени озвучивания, использовании волноводов с различными формами головок in vitro.

Наблюдение за динамикой размера пектинатных микросфер в растворах, обработанных ультразвуком, при комнатной температуре в течение 20 минут показало отсутствие агломерации частиц в течение всего времени наблюдения(p> 0,05).

Выводы

1. Воздействие УЗ с использованием плоской и шаровидной головок волноводов на суспендированные растворы пектинатных микросфер (ПМ) приводит к достоверному уменьшению их размера (p<0,05) Степень диспергирования микрочастиц имеет прямую зависимость от интенсивности и продолжительности и не зависит от скважности.

2. Наиболее значимым кавитационным эффектом обладает волновод с шаровидной формой головки без отверстия. Максимальная степень диспергирования микросфер на уровне 98% отмечена при использовании шаровидной головки без отверстия через 120 секунд воздействия при уровне интенсивности 46,2 Вт/см² и скважности 45%.

3. Нахождение растворов пектинатных микросфер, обработанных ультразвуком, при комнатной температуре в течение 20 минут не сопровождается агломерацией частиц.

Литература

1. Nishioka T., Luo H., Fishbein M.C. et al. Dissolution of thrombotic arterial occlusion by high intensivity, low frequency ultrasound and dodecafluoropentane emulsion: an in vitro and in vivo study // J. Am. Coll. Cardiol. – 1997. – Vol. 30. – P. 561-568.

2. Rosenschein U., Rosenszajn L., Krans L. et al. Ultrasonic angioplasty in totally occluded peripheral arteries: initial clinical, histological and angiographical results // Circulation. – 1991. – Vol. 83. – P. 1976-1978.

3. Ефимова Н.Н., Адзерихо И.Э., Денисевич Т.Л. и др. Влияние типа волновода на эффективность тромборазрушающего действия ультразвука in vitro // Мед. журнал. – 2008. – №3. – С.44-46.

4. Porter T.R., LeVeen R.F., Fox R., Kricsfeld A., Xie F. Thrombolytic enhancement with per-fluorocarbon-exposed sonicated dextrose albumin microbubbles. // Am Heart J. – 1996. – Vol. 132. – P. 964-968.