Медицина

Назаренко Р.В.

Луганский государственный медицинский университет

Изучение влияния бактериальных эндотоксинов на апоптоз Т-лимфоцитов крови in vitro

Структурные компоненты клеточных стенок бактерий – липополисахариды (ЛПС), пептидогликаны (ПГН), тейхоевые кислоты (ТК) являются мощными эндотоксинами, влияющими на метаболическую активность и функциональное состояние клеток иммунной системы. Взаимодействие бактериальных эндотоксинов с иммунноцитами, в том числе и с Т-лимфоцитами, обусловливает формирование иммунодефицитного состояния, преимущественно по супрессорному варианту. Одной из причин развития иммунодефицита является апоптоз иммунных клеток, при котором происходит изменение метаболического статуса иммунноцитов, что проявляется в активации процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и недостаточности ферментативной системы антиоксидантной защиты (АОЗ), в развитии дисбаланса в системе циклических нуклеотидов, в нарушении системы энергообеспечения клеток

Цель работы. Изучить влияние бактериальных эндотоксинов на аптоз Т-лимфоцитов крови человека in vitro.

Материал и методы исследования. Для проведения исследований было использовано 370 культур лимфоцитов периферической крови, изолированных из крови 89 практически здоровых доноров мужского пола, в возрасте от 18 до 24 лет (средний возраст – 21,9±0,6 года).

Проведенные исследования позволили отметить, что бактериальные эндотоксины способны существенно влиять на апоптоз субпопуляций Т-лимфоцитов. При этом степень выявленного воздействия значительно различалась, в зависимости от вида используемого в эксперименте эндотоксина.

Так, было установлено, что непосредственный контакт ТК, ПГН S. haemolyticus и ЛПС B. merdae в действующих концентрациях 100 мкг/мл стимулируют in vitro апоптоз CD4+-лимфоцитов и CD8+-лимфоцитов периферической крови человека, что выражалось в увеличении количества клеток с морфологическими признаками апоптоза, о чём свидетельствовало повышение индекса апоптоза (ИА), а также в увеличении количества клеток, экспонирующих на поверхности своих цитоплазматических мембран неспецифические (CD38) и специфические (CD95) маркеры апоптоза, указывающие на готовность, как CD4+-лимфоцитов, так и CD8+-лимфоцитов к реализации апоптозной программы.

Наибольший апоптогенный потенциал был присущ ЛПС B. merdae, умеренный – ПГН и ТК S. haemolyticus. Наиболее чувствительной к апоптогенному действию бактериальных эндотоксинов оказалась субпопуляция CD4+-лимфоцитов, тогда как субпопуляция CD8+-лимфоцитов характеризовалась большей резистентностью к влиянию бактериальных эндотоксинов.

Как следует из материалов, наименьшее негативное воздействие на субпопуляции Т-лимфоцитов оказывали ТК. Так, под влиянием последних, использованных в действующей концентрации 100 мг/л и экспозиции 6 ч ИА CD4+-лимфоцитов (Т-хелперы/индукторы), составив в среднем 12,3±0,6%, оказался в 2,93 раза выше референтной нормы (р<0,001). При использовании аналогичных доз ПГН и ЛПС ИА CD4+-лимфоцитов превысил референтную норму в 3,45 и 4,74 раза соответственно (в обоих сопоставлениях р<0,001).

Весьма сходная динамика изменений ИА под воздействием ТК, ПГН и ЛПС регистрировалась и в культурах CD8+-лимфоцитов, идентифицируемых как субпопуляцию Т-супрессоров/цитотоксиков. Под влиянием ТК ИА CD8+-лимфоцитов в конце опытов превысил референтную норму в 2,18 раза, а под воздействием ПГН и ЛПС – в 2,94 и в 3,73 раза, соответственно (р<0,001 во всех случаях сопоставления).

Под влиянием бактериальных эндотоксинов существенно возрастало количество СD38+-клеток. Так, в присутствии ТК удельный вес CD38+-CD4+-лимфоцитов на 6 ч опыта оказался выше показателя референтной нормы в 2,86 раза (р<0,001). В то же время, в присутствии ПГН и ЛПС увеличение количества CD38+-CD4+-лимфоцитов составило 3,8 и 5,13 раза, соответственно. То есть, наибольший апоптогенным потенциалом из числа тестируемых эндотоксинов обладали ЛПС B. merdae.

Аналогичные по направленности изменения регистрировались и в культурах CD8+-лимфоцитов, взаимодействовавших с бактериальными эндотоксинами. Как выяснилось в конце опытов, относительно референтной нормы удельный вес CD38+-CD8+-лимфоцитов контактировавших с ТК был повышенным в 2,49 раза, а после взаимодействия с ПГН и ЛПС – в 3,68раза и в 5,4 раз, соответственно (р<0,001 во всех случаях сопоставления).

Под влиянием бактериальных эндотоксинов удельный вес CD95+-CD4+-лимфоцитов и CD95+-CD8+-лимфоцитов также повышался, при этом под влиянием ЛПС B. merdae – наиболее значительно. Так, непосредственный контакт CD4+-лимфоцитов с ТК, ПГН и ЛПС сопровождался увеличением удельного веса CD95+-CD4+-лимфоцитов относительно референтной нормы в 3,23, 3,82 и в 5,28 раза, соответственно. Для CD95+-CD8+-лимфоцитов подобные степени увеличения удельного веса составили в присутствии ТК 2,43 раза, в присутствии ПГН – 3,29 раз, а в присутствии ЛПС – 4,93 раза (р<0,001 во всех случаях сравнения).

Как следует из приведенного выше сопоставительного анализа, кратности прироста клеток с маркерами апоптоза в субпопуляции CD4+-лимфоцитов были существенно выше аналогичных в субпопуляции CD8+-лимфоцитов. Это даёт основание говорить о том, что субпопуляция CD4+-лимфоцитов наиболее чувствительна к воздействию бактериальных эндотоксинов, по сравнению с субпопуляцией CD8+-лимфоцитов. Данный факт объясняет нередкую ситуацию, когда при разных бактериальных заболеваниях наибольший дефицит в периферической крови больных имеют Т-хелперы/индукторы, в связи с чем формируется относительный супрессорный вариант иммунодефицита.

Таким образом, результаты проведенного исследования позволяют утверждать, что бактериальные эндотоксины, а именно ТК и ПГН S. haemolyticus, а также ЛПС B. merdae в действующих дозах 100 мкг/мл и при непосредственном контакте с CD4+-лимфоцитами и CD8+-лимфоцитами периферической крови человека стимулируют в них апоптоз, что выражается в увеличении количества клеток с морфологическими признаками апоптоза, а также количества клеток, несущих на себе, как неспецифические, так и специфические маркеры апоптоза - CD38 и CD95. При этом наибольший апоптогенный потенциал проявляли ЛПС, умеренный – ПГН, наименьший - ТК. По сравнению с CD8+-лимфоцитами, CD4+-клетки оказались более чувствительны к апоптогенному влиянию использованных бактериальных эндотоксинов.