МОЛЕКУЛЯРНО-КЛЕТОЧНЫЕ МАРКЕРЫ ДИСПЛАЗИИ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ

Дворниченко М.В., Саприна Т.В., Хлусов И.А., Сизикова А.Е., Больбасов Е.Н., Подъяблонский А.С., Дмитриева Л.А.

ГБОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Минздрава России, ФГБОУ ВПО Национальный исследовательский Томский политехнический университет, НОЦ «Биосовместимые материалы и биоинженерия», г. Томск, Россия

Аннотация Проведена оценка молекулярно-клеточных параметров краткосрочной культуры мононукларных лейкоцитов периферической крови в присутствии 3D матриц у пациентов с дисплазией соединительной ткани. Выявлено изменение морфологического фенотипа клеточных элементов (увеличение доли фибробластоподобных клеток), а также выраженные молекулярные реакции (секреция остеокальцина и CrossLaps в кондиционные жидкости) при их краткосрочном контакте с искусственными материалами (наноструктурированные титановые образцы имплантатов, несущие двусторонние кальций-фосфатное покрытие). Оценка молекулярно-генетических реакций клеток на биосовместимые имплантаты может рассматриваться как методологическая платформа для персонализированного доклинического тестирования эффективности биоматериалов, применяемых в терапии осложнений патологии опорно-двигательного аппарата при наследственных коллагенопатиях.

Введение В настоящее время актуализируется вопрос прогрессирующего распространения заболеваний сердечно-сосудистой системы (42%) и опорно-двигательного аппарата (77%) среди молодежи. Одной из причин развития таких заболеваний является недифференцированная форма дисплазия соединительной ткани. В основе патогенеза заболевания лежит дезорганизация кооперации молекулярно-клеточных процессов за счет генетически детерминированного дефекта формирования органической основы экстрацеллюлярного матрикса. В связи с чем, актуально не только поставить диагноз, но спрогнозировать, персонализировать заболевание.

В настоящее время диагностика недифференцированных форм дисплазии базируется на комплексной оценке фенотипических маркёров, при которой выделяют внешние и висцеральные маркёры (Кадурина Т.И., 2000). Но даже схема скрининг-диагностики предложенная Т. Милковска-Дмитровой и А. Каркашевым (1985) (Милковска-Дмитрова Т., 1987) является громоздкой и малознакомой практикующим врачам и требует уточняющих лабораторных мероприятий .

Цель. В связи с вышесказанным целью настоящей работы была разработка малоинвазивной, экономически доступной методологии диагностики дисплазии соединительной ткани in vitro.

Материалы и методы. Материалом исследования была периферическая кровь как здоровых доноров 6 человек, так и 6 пациентов с дисплазией соединительной ткани с синдромом дисплазии соединительной ткани. Для постановки диагноза была изучена клиническая картина с оценкой диспластических изменений в соединительной ткани по классификации D.O. Sillence (Sillence D.O., Хлусов И.А., Саприна Т.В., Нечаев К.А., и соавт., 2010). Синдром ДСТ был поставлен на основании полного физикального исследования с оценкой стигмального статуса, использования расчетных индексов и клинических тестов: тесты на наличие арахнодактилии и долихостеномелии, определение гипермобильности суставов по тесту Бейтона, плантографии. Определение степени тяжести ДСТ по критериям Милковска-Димитровой Т., Каркашеву А. в модификации Фоминой Л.Н. (2001), согласно которым у всех пациентов основной группы синдром ДСТ оценен как «тяжелый». Причиной синдрома ДСТ у всех пациентов основной группы явилась врожденная патология - несовершенный остеогенез (по 3 пациента с IVA и III типом заболевания по классификации Sillence).

В качестве экспериментальной модели была предложена краткосрочная культура мононуклеарных лейкоцитов периферической крови в присутствии трехмерного искусственного материала (3D матрицы) с кальцийфосфатной поверхностью (Карлов А.В., Больбасов Е. Н.. 2011), несущей оптимальную плотность распределения микротерриторий определенного размера (“ниш“), стимулирующих стромальные стволовые клетки к дифференцировке и созреванию. Критериями оценки явилось подтверждение по данным анализа структурно-метаболического статуса формирования фибробластоподобного фенотипа (Хлусов И.А. и соавт., 2010), а именно цитохимический анализ на неспецифическую эстеразу по способу Леффлера, щелочную фосфатазу методом азосочетания по G. Gomori в модификации А.Г. Михеева (1972) или кислую фосфатазу методом азосочетания по A. Goldberg, Т. Barka (1962) (Меньшиков В.В., 1987). А также морфологическая оценка фибробластоподобной согласно методам компьютерной морфометрии (Новицкий В.В., Шахов В.П., Хлусов И.А. 2004). В кондиционных средах иммуноферментным методом реактивами Nordic Bioscience Diagnostics (Дания) оценивали маркеры костного ремоделирования (концентрации остеокальцина, продуктов деградации коллагена I типа (CrossLaps)). Секреторную реакцию мононуклеаров крови здоровых добровольцев на контакт с искусственными материалами оценивали в процентном выражении от соответствующей реакции клеток на пластик. Для описания изменчивости количественных признаков использовали общепринятые статистические процедуры.

Результаты Показано повышение доли клеток, имеющих фибробластоподобный фенотип, в 9,4 раз после культивирования в присутствии 3D матриц, имитирующих естественное микроокружение для мезенхимных тканей (несущих ниши для стромальных стволовых клеток), по сравнению с показателями контрольной группы (23,5% среди мононуклеарных лейкоцитов, прилипающих к пластику по сравнению с 2,5%). В клетках зарегистрирована положительная цитохимическая окраска на кислую фосфатазу и неспецифическую эстеразу.

Показатели секреторной активности in vitro мононуклеаров крови (% от контроля на пластиковой поверхности лунок планшета) через 52 ч после контакта с тестируемыми образцами, Х±SD

Группа наблюдений	Изучаемые показатели в кондиционных средах культур клеток
	Остеокальцин	CrossLaps
Здоровые добровольцы, n=4	116,67±42,36	141,94±130,65
Дисплазия соединительной ткани, n=6,	78,86±10,01*	104,09±29,25

Примечание: * – статистически значимые различия (p<0,05) с культурой клеток на пластике согласно Т-критерию Вилкоксона; n – число обследованных добровольцев.

Для пациентов с дифференцированной формой дисплазии соединительной ткани показано повышение доли клеток, имеющих фибробластоподобный фенотип, в 9,4 раз по разработанной методологии, по сравнению с показателями здоровых доноров. При изучении маркеров костного метаболизма в супернатантах мононуклеаров, выделенных из крови здоровых добровольцев и контактировавших с имплантатами, не выявлено достоверных изменений уровней остеокальцина и CrossLaps по сравнению с культурой клеток на пластике. В свою очередь, в группе больных с дисплазией соединительной ткани имело место статистически значимое снижение (более чем на 21 %) концентрации молекул остеокальцина как проявление негативной функциональной реакции лейкоцитов на искусственный материал.

Выводы Полученные результаты свидетельствуют о морфофункциональной нестабильности культуры периферической крови пациентов с дисплазией соединительной ткани в присутствии 3D матриц, имитирующих внеклеточный матрикс, а зарегистрированные изменения могут служить критерием персонализированной в диагностике дисплазии соединительной ткани.

Список литературы

1. Кадурина Т.И. Поражение сердечно-сосудистой системы у детей с различными вариантами наследственных болезней соединительной ткани // Вестник аритмологии. – 2000. – №18. – С.87 – 92

2. Меньшиков В.В., Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник. М.: Медицина; 1987.

3. Милковска-Дмитрова Т. Врождена соеденительнотканна малостойкость у децата. – София: Медицина и физкультура; 1987. – 189c.

4. Новицкий В.В., Шахов В.П., Хлусов И.А., редакторы. Введение в методы культуры клеток, биоинженерии органов и тканей. Томск:и STT; 2004.

5. Способ получения биологически активного покрытия Карлов А.В., Больбасов Е. Н. Тип: патент на изобретение Номер: 2428207 Страна: Россия Патентообладатель: Общество с ограниченной ответственностью Концерн Научно-Производственное объединение "Биотехника Плюс" Год: 2011 Дата регистрации: 05.05.2010 Цит. в РИНЦ: 0 Адрес: 634029, г.Томск, пер. Плеханова, 5, ООО "КНПО "Биотехника Плюс.

6. Хлусов И.А., Нечаев К.А., Шевцова Н.М., Хлусова М.Ю., Дворниченко M.B., Зайцев К.В., Колокольцова Т.Д., Больбасов Е.Н., Шаркеев Ю.П., Легостаева Е.В., Сабурина И.Н.; К вопросу о фибробластоподобных клетках в периферической крови человека; Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2010. Т. 5. № 4. С. 72-78.

7. Хлусов И.А., Саприна Т.В., Нечаев К.А., Дворниченко М.В., Шевцова Н.М., Зайцев К.В., Попков А.В. Морфофункциональные особенности культуры мононуклеарных клеток крови у больных несовершенным остеогенезом: клинико-диагностическое наблюдение//Бюллетень сибирской медицины. 2010. Т. 9. № 6. С. 71-79.

8. Sillence D.O., Senn A., Danks D.M. Genetic heterogeneity in osteogenesis imperfecta // J. Med. Genet. 1979. Vol. 16. P. 101-116