ИНДИВИДУАЛЬНАЯ БИОСОВМЕСТИМОСТЬ ИМПЛАНТИРУЕМЫХ МАТЕРИАЛОВ В ТРАВМАТОЛОГИИ И ОРТОПЕДИИ

Дворниченко М.В., Хлусов И.А., Сизикова А.Е., Подъяблонский А.С., Дмитриева Л.А.

ГБОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Минздрава России, ФГБОУ ВПО Национальный исследовательский Томский политехнический университет, НОЦ «Биосовместимые материалы и биоинженерия», г. Томск, Россия

Аннотация

Изучена секреция цитокинов в клеточных культурах при их контакте in vitro с имплантатами, несущими микродуговые, магнетронные или абляционные кальцийфосфатные покрытия. Установлено, что клетками, способными контролировать процессы приживления/отторжения имплантатов с разной шероховатостью, являются, в первую очередь, мононуклеарные лейкоциты крови.

I. Введение. По данным мировой статистики (ВОЗ, 2011) около 15% среди 600 млн. инвалидов в мире составляет травматологический профиль, а одной из основных причин такого распространения является высокая частота наличие патологии опорно-двигательного аппарата (6,89% трудоспособного населения). При этом в случае оперативного лечения (остеосинтез, протезирование) количество осложнений у данной категории лиц составляет от 5,7 до 54%, одной из причин которых является негативная реакция костной ткани на имплантируемые биосовместимые (в том числе и наноструктурные) материалы (Севастьянов В.И., 1999; Ratner B.D. et al., 2004). Стандартизация и сертификация медицинских материалов выполняется согласно ГОСТ Р ИСО 13485 (ISO 13485). При переходе на персонализированную медицину прогноз предусматривает изменение модели терапии: индивидуализация реабилитационных мероприятий, в том числе и фармтерапии на основе биомаркеров. Однако, принципы персонафицированной терапии в области остеосинтеза и протезирования не реализуются в силу отсутствия технологических приемов. Стратегия оценки безопасности применения новых биосовместимых материалов представлена в MP 1.2.0024-11 и МР 1.2.2522-09. В данных документах представлены рекомендации по оценке потенциального риска наноматериалов для здоровья и жизни человека на уровне санитарно-гигиенических и токсикологических исследований. Данные методы уже внедряются в систему сертификации разрабатываемых медицинских материалов.

Оценка индивидуальной биосовместимости материала с учетом молекулярно-клеточных маркеров интеграционных свойств (иммунологическая реактивность) в зависимости от назначения имплантируемого материала актуальна в силу широкой распространенности основных патологий (атеросклероз, сахарный диабет и др.).

II. Постановка задачи. Разработать экспериментальную валидизацию процессов биоинтеграции материалов с костной тканью in vitro с возможностью оценки эффективность их клинического применения.

III. Результаты Материалом исследования была периферическая кровь здоровых доноров 6 человек. В качестве экспериментальной модели была предложена краткосрочная культура мононуклеарных лейкоцитов периферической крови в присутствии модельных дисков трехмерного искусственного материала. Контролем явилась культура пренатальных фибробластоподобных клеток легкого. Препараты представляют собой популяцию клеток разной формы и размеров, что характерно для пула мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток (Aerts F., Wagemaker G., 2006), сохраняющую при пассажах стабильный кариотип. Клетки свободны от посторонних вирусных (ВИЧ, гепатит, герпес и др.) и бактериальных агентов (сифилис, микоплазмы, хламидии и др.). Жизнеспособность клеток, определяемая согласно ISO 10993-5 по исключению окрашивания в тесте с 0,4 % трипановым синим, составила 95%.

Для оценки молекулярных реакций на модельные имплантаты мононуклеарные лейкоциты выделяли из периферической крови в стерильных условиях методом центрифугирования в течение 10 мин при 500g с использованием градиента плотности Ficoll-Paque (Pharmacia, Швеция) (ρ = 1,077 г/см³). Взвесь клеток (жизнеспособность более 95%) культивировали в течение 72 ч при температуре 36°С в концентрации 5·106 мононуклеаров на лунку в 1 мл полной культуральной среды, способствующей остеогенной дифференцировке клеток: 80% среды ДМЕМ/F12 (1 : 1), 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина сульфата, 10 ммоль бета-глицерофосфата, 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты, 10–6 моль дексаметазона, 10 ммоль HEPES-буфера (Новицкий В.В., Шахов В.П., Хлусов И.А.., 2004). Супернатанты (кондиционные жидкости) получали путем забора надосадочной части клеточных культур, их центрифугирования в течение 10 мин при 500g. В кондиционных средах иммуноферментным методом оценивали уровни фактора некроза опухоли (TNFα) и интерлейкинов (IL-2, IL-4).

В качестве модельных материалов применяли изготовленные в ИФПМ СО РАН подложки из наноструктурированного титана ВТ1.0 (диаметр 12 мм, толщина 1 мм), несущие двусторонние кальций-фосфатные покрытия. Наноструктурные покрытия наносили на титановую подложку с помощью модификации способа микродугового оксидирования в электролите как описано ранее (Sharkeev Yu.P. et al., 2009).

Шероховатость поверхности (Ra) искусственных покрытий оценивали по значениям параметров вертикальных неровностей профиля с помощью измерительной системы Talysurf 5-120 (разрешающая способность 10 нм). Определяли Ra (мкм) как средний результат шероховатости в пределах нескольких длин участков измерений согласно ГОСТ 2789-73. Измеренный индекс Ra фиксировали для всех модельных матриксов в одном диапазоне (1,33-1,44 мкм), чтобы нивелировать известный эффект шероховатости на поведение клеток (Хлусов И.А., Пичугин В.Ф., Гостищев Э.А., и соавт., 2011).

Выявлено влияние параметров покрытия (шероховатость) на продукцию цитокинов в краткосрочной культуре как мононуклеаров периферической крови, так и пренатальных фибробластоподобных клеток легкого (табл.).

Таблица

Уровни цитокинов в супернатанте при краткосрочной культивировании с искусственными материалами, Х+m

Уровень цитокинов, пг/мл	Исследуемая группа
	Микродуговое покрытие	Абляционное покрытие	Магнетронное покрытие	Контроль секреции на пластике
Культура фибробластоподобных клеток человека
TNFα	51,56 ± 3,93	46,91 ± 2,79	62,26 ± 3,47*	46,52 ± 0,67
IL-4	77,57 ± 1,07	72,14 ± 1,16*	77,32 ± 1,59	78,01 ± 0,44
IL-2	68,77 ± 3,61	49,98 ± 0,67*	65,86 ± 3,33	66,33 ± 1,28
Культура мононуклеаров крови
TNFα	40,98 ± 1,25	79,19 ± 2,08*	59,74 ± 15,53	41,74 ± 0,60
IL-4	66,88 ± 1,30	61,51 ± 1,02	67,27 ± 1,45	63,74 ± 0,93
IL-2	73,36 ± 1,66*	61,73 ± 0,80	68,35 ± 3,41	63,91 ± 0,70

Примечание: указаны различия по U-критерию Вилкоксона: (*) – с группой контроля на пластике (p < 0,05)

Имплантаты с шероховатым (среднее Ra = 2,947 мкм, n = 3) КФ покрытием, сформированным микродуговым способом, не влияли на секрецию цитокинов в культуре фибробластоподобных клеток (табл.). При контакте c «гладкими» КФ покрытиями жизнедеятельность клеточной культуры стромальных стволовых клеток может зависеть от выделения TNFα (магнетронный способ нанесения покрытия, Ra = 0,197 мкм, n = 3) или торможения секреции IL-2 и IL-4 (абляционный способ нанесения покрытия, Ra = 0,127 мкм, n = 3). Таким образом, секреторная активность многоклеточной системы в культуре фибробластоподобных клеток при контакте с «гладкими» искусственными покрытиями может быть одним из молекулярных механизмов в регуляции функциональной активности клеток и судьбы имплантатов в организме.

Отмечено увеличение концентрации TNFα (на 93 %) и IL-4 (на 15 %) в культуре мононуклеарных лейкоцитов периферической крови при контакте с абляционным и микродуговым покрытиями соответственно. Использование корреляционного анализа для выявления механизмов описанных феноменов показало, что секреторная активность культуры фибробластоподобных клеток не зависела от шероховатости КФ покрытий. В то же время, выявлены тесные зависимости Ra покрытий с секрецией TNFα мононуклеарами крови (r = -0,80; p = 0,01; n = 9), Il-2 (r = 0,69; p = 0,04; n = 9) и IL-4 (r = 0,83; p = 0,006; n = 9).

IV. Выводы Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования краткосрочной культуры мононуклеарных лейкоцитов периферической крови в качестве экспериментальной модели биоинтеграции материалов, а определение основных цитокинов в кондиционных средах в качестве персонализированных маркеров типа реакции на имплантат.

Список литературы

1. Биосовместимость. Под ред. В.И. Севастьянова. 1999, 368 с

2. Введение в методы культуры клеток, биоинженерии органов и тканей / под ред. В.В. Новицкого, В.П.Шахова, И.А. Хлусова. Томск: STT, 2004. 386 с.

3. Всемирный доклад об инвалидности. 2011 г. ВОЗ

4. ГОСТ Р ИСО 13485 (ISO 13485).

5. Мировой статистики здравоохранения 2011 г." ВОЗ

6. МР 1.2.2522-09

7. MP 1.2.0024-11

8. Хлусов И.А., Пичугин В.Ф., Гостищев Э.А., Шаркеев Ю.П., Сурменев Р.А., Сурменева М.A., Легостаева Е.В., Чайкина М.В., Дворниченко М.В., Морозова Н.С. Влияние физических, химических и биологических манипуляций на поверхностный потенциал кальций-фосфатных покрытий на металлических подложках // Бюллетень сибирской медицины. 2011. Т. 10. № 3. С. 72-81.

9. Aerts F., Wagemaker G. Mesenchymal stem cell engineering and transplantation // Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells / ed. by J.A. Nolta. – The Netherlands, Dordrecht: Springer, 2006. – P. 1–44

10. Ratner Buddy D. e.a. (ed.). Biomaterials Science: An Introduction to Materials in Medicine 2nd Edition Elsevier Academic Press, 2004

11. Sharkeev Yu.P., Legostaeva E.V., Eroshenko A.Yu., Khlusov I.A. and Kashin O.A. The structure and physical and mechanical properties of a novel biocomposite material, nanostructured titanium-calcium-phosphate coating // Composite Interfaces. 2009. Vol. 16. P. 535-546