Биологические науки/9. Биохимия и
биофизика
Д.т.н. Черно Н.К., к.х.н. Озолина С.А., Тирон-Воробьева Н.Б.
Одесская национальная академия пищевых
технологий, Украина
Лизоцимы растений
семейства Brassicаceae (капустных) как альтернатива лизоциму белка куриных яиц
Лизоцим – фермент, катализирующий гидролиз определенных связей в
полисахаридах цитоплазматических
мембран бактериальных клеток, что приводит к их разрушению. Таким образом, лизоцим выполняет
функцию неспецифической антибактериальной защиты. Наряду с некоторыми другими белками, обладающими бактерицидными
свойствами (интерферон, трансферрин), он находится в слюне, носовой слизи,
слезах, желудочном соке, способствуя поддержанию в этих средах нормальной
бактериальной флоры.
Этим объясняется то, что лизоцим (как правило, белка куриных яиц)
все чаще используют в составе разнообразных медицинских препаратов в сочетании
с другими компонентами природного и синтетического происхождения. В частности,
такие мультиферментные лизоцимсодержащие препараты, как «Somazyme» (Life plus™, США), «Lysozyme
Plus» (Life Extension Institute, Scottsdale, США) предназначены для повышения иммунного
статуса организма, коррекции функции поджелудочной железы, обладают противовоспалительным
действием [1, 2]. Однако в этих случаях лизоциму принадлежит второстепенная
роль – он способствует более эффективному действию других составляющих. Как
примеры препаратов, где лизоцим является основным действующим веществом, следует
упомянуть «Лисобакт» (Босния и Герцеговина), «Ларипронт» (Германия), «Лизак»
(Украина). Они рекомендованы при инфекционно-воспалительных процессах полости
рта, глотки. Кроме того, при некоторых заболеваниях, сопровождающихся уменьшением
содержания лизоцима в слизистой оболочке желудка, для восстановления ее
защитных функций рекомендуется дополнительное введение этого фермента в организм
человека [3, 4].
В свете сказанного
представляет интерес получение диетических добавок с лизоцимной активностью. При
этом предпочтительным является использование для этих целей растительного сырья,
поскольку это создаёт минимальные риски побочных эффектов для организма
человека.
В качестве объектов
исследования нами рассматривались диетические добавки с лизоцимной активностью
на основе капусты белокочанной (Brassica
oleracea) и корнеплодов хрена обыкновенного (Armoracia
rusticana). Их получали смешиванием
сока/экстракта этих растений с растворами яблочного пектина или хитозана при
определенных условиях. При этом образовывались нерастворимые комплексы, в составе
которых концентрировалось 65,4…91,5 % содержащего в соке Brassica oleracea
лизоцима и 85,5…94,0 % фермента, присутствующего в экстракте корнеплодов Armoracia
rusticana. По удельной лизоцимной активности комплексы превосходили
сок/экстракт в 3,5…4 раза.
При изучении физико-химических
свойств полученных комплексов, учитывая возможные направления их дальнейшего
использования, внимание акцентировали на их поведении при значениях рН,
соответствующих таковым ротовой полости и желудочного сока при физиологической
температуре организма человека.
Лизоцимы Armoracia
rusticana и Brassica oleracea
в составе комплексов с полисахаридами имеют различные значения рН-оптимумов
(рис. 1, 2). Так, для комплексов лизоцима Brassica oleracea рН-оптимум
составляет 6,5 ед. рН, он четко выражен и очень близок как по форме
кривой, характеризующей зависимость лизоцимной активности от величины рН, так и
по величине рН-оптимума к лизоциму белка куриных яиц [5]. Что касается комплексов
лизоцима Armoracia rusticana,
то их рН-оптимум (3,5 ед. рН)
смещен в область кислых значений рН, причем он значительно расширен по
сравнению с упомянутыми выше образцами и свыше 90 % от своей максимальной
активности сохраняет в интервале значений рН от 2,0 до 5,0.
|
|
|
|
Рис.1. Влияние рН на
лизоцимную активность комплексов (t = (37±1) С): |
Рис.2. Влияние рН на лизоцимную активность комплексов (t = (37±1) С): |
Термооптимум лизоцима в
составе комплексов Brassica oleracea составляет 37 °С (рис. 3).
|
|
|
|
Рис.3. Зависимость
лизоцимной активности комплексов от температуры: |
Рис.4. Зависимость лизоцимной активности комплексов от температуры: |
Кривая
зависимости лизоцимной активности комплексов на основе Armoracia rusticana от температуры
(рис. 4) имеет более пологий характер, термооптимум расширен, при 37 °С сохраняется 92…97
% от их максимальной активности, оптимум соответствует 60 °С. Такой же
величиной характеризуется термооптимум одноименного фермента белка куриных яиц [5].
Показано, что рН-стабильность
фермента в составе всех исследуемых комплексов сохраняется при значениях рН 5,5
на уровне 75…94 % от максимальной в течение 30 минут, снижаясь до 70 % к 60 мин
инкубации (рис. 5, 6).
|
|
|
|
Рис.5. рН-стабильность
комплексов на основе Brassica oleracea: 1 – комплекс «лизоцим-хитозан»; 2 – комплекс
«лизоцим-пектин». |
Рис.6. рН-стабильность комплексов на основе Armoracia
rusticana: 1 –комплекс
«лизоцим-хитозан»; 2 – комплекс
«лизоцим-пектин». |
|
|
|
|
Рис.7. Термостабильность комплекса «лизоцим-хитозан» Brassica oleracea |
Рис.8. Термостабильность комплекса «лизоцим-хитозан»
Armoracia rusticana (рН = 3,5): 1 – t
= (37 ± 2) ºС; 2 – t = (80 ± 2) С;
3 – (100 ± 2) ºС. |
В кислой среде (рН = 2)
образцы сохраняют свою активность в течение длительного времени. Наилучший
результат получен для комплекса «лизоцим-хитозан» Armoracia rusticana.
Комплексы с хитозаном
устойчивы и при рН = 2. Они сохраняют 75…80 % своей максимальной активности в течение
1 часа, через 6 часов инкубации она остается на уровне 65…75 %.
Комплексам
присуща довольно высокая термостабильность, в первую очередь это относится к
хитозансодержащим образцам (рис. 7, 8).
Дана характеристика
антибактериальной активности комплексов на основе растительных лизоцимов в
сравнении с лизоцимом белка куриных яиц (табл. 1).
Таблица 1
Бактерицидная
активность лизоцимсодержащих комплексов
|
№ п/п |
Штаммы бактерий |
Зоны просветления, мм |
||||
|
Лизоцим белка куриных яиц |
Лизоцимсодержащие комплексы |
|||||
|
Brassica oleracea |
Armoracia rusticana |
|||||
|
с пек- тином |
с хитозаном |
с пектином |
с хито- заном |
|||
|
1 |
Bacillus subtilis |
устойчивы |
||||
|
2 |
Bacillus cereus |
устойчивы |
||||
|
3 |
Micrococcus luteus |
30 |
устойчив |
30 |
39 |
42 |
|
4 |
Staphylococcus aureus |
устойчивы |
||||
|
5 |
Escherichia coli |
25 |
25 |
25 |
30 |
30 |
|
6 |
Klebsiella pneumoniae |
25 |
25 |
25 |
30 |
30 |
|
7 |
Pseudomonas aeruginosa |
20 |
25 |
25 |
32 |
32 |
|
8 |
Salmonella enteritidis |
20 |
25 |
25 |
32 |
32 |
|
9 |
Planococcus citreus |
35 |
25 |
35 |
30 |
40 |
Отмечено бактериостатическое действие
всех испытуемых препаратов в отношении Гр− бактерий (Echerichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonаs aeruginosa). По
отношению к Salmonella enteritidis и Planococcus citreus комплексы на основе хитозана
более эффективны, нежели лизоцим белка куриных яиц. Что касается Micrococcus luteus, лизоцимсодержащие растительные комплексы на основе Armoracia rusticana не только не уступают лизоциму белка куриных
яиц, но и превосходят его.
Анализ полученных результатов
позволяет положительно оценить конкурентоспособность белок-полисахаридных
комплексов с лизоцимной
активностью на основе растений семейства Brassicаceae в качестве диетических добавок
антимикробной направленности. Добавка, включающая хитозан и лизоцим Armoracia
rusticana, не уступает лизоциму белка
куриных яиц, а при
необходимости применения экзогенного лизоцима для восстановления его концентрации
в желудочном соке, может иметь некоторые преимущества, учитывая величину
рН-оптимума ее лизоцимной составляющей и ее стабильность в кислой среде.
Литература:
1. Lysozyme plus – Enzymes for inflammation [Электронный ресурс]. –
Электронные текстовые данные (830 байт). – Режим доступа: <http://www.lifeplusvitamins.com/somazyme.htm>.
2.
Active enzymes for a healthy youthful body [Электронный
ресурс]. –
Электронные текстовые данные (950 байт). – Режим доступа: <http://www.lifeextensionvitamins.com>.
3. Заявка Японии A61K9/16. Spherical anti-inflammatory and anti-cancer enzyme granules and method
for preparing the same [Text] / H. J. Hwan, K. J. Cheon, K. H. Soo,
K. W. Sik. – № 20070012040. – заявл.
22.07.2005; опубл. 25.01.2007.
4. Заявка Японии № 61-143316. A61K31/455. Preparation of stable tablet [Text] / Terazono Takashi. – № 61-143316. – заявл. 01.07.1986; опубл. 25.04.1995.
5. Баранов, А. А. Лизоцим: теория и практика [Tекст] / А. А. Баранов, В. Г. Дорофейчук – М.: Н. Новгород: Информатика. – 1999. – 126 с., ил.