Цыбенова Л.Г.

ФГБОУ ВПО Восточно-Сибирский государственный университет

технологий и управления

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ АКТИВНОСТИ ЛЕКТИНОВ

В СОЕВОМ МОЛОКЕ

Лектины представляют собой биологически активные вещества белковой природы, которые способны обратимо взаимодействовать с гликозилированными биополимерами клеточных мембран с образованием комплекса рецептор-лектин, не вызывая при этом их химического превращения [1]. Отличительной особенностью целого ряда лектинов является их способность вызывать агглютинацию эритроцитов крови вследствие того, что лектины в изобилии содержатся в самых распространенных продуктах питания (зерновых, бобовых, овощах и морепродуктах). По данным медицинских исследований, около 5 % лектинов, поступивших в организм с пищей, не разлагается в желудочнокишечном тракте и, попадая в кровь, вызывают разрушения красных и белых кровяных клеток [2].

Лектины участвуют в процессах углевод-белкового узнавания, играют большую роль в межклеточном связывании, в процессах передачи сигналов в биологических системах, а также обладают широким спектром биологической активности и находят применение в различных областях биологии и медицины.

Целью работы являлась изучение гемагглютинирующей активности лектинов в соевом молоке.

Материалы и методы исследований.

Объектами исследований являлись образцы соевого молока компаний-производителей Японии.

Гемагглютинирующую активность лектинов определяли по реакции агглютинации эритроцитов крови кролика [3]. Для повышения чувствительности реакции эритроциты обрабатывали протеолитическим ферментом трипсином при 37 °С в течение 30 мин. Кровь отбирали в гепаринизированный шприц и эритроциты промывали трехразовым переосаждением в фосфатно-солевым буферном растворе (ФСБ) при 4 °С, 10000 rpm, в течение 10 мин. Окончательный осадок эритроцитов суспензировали в 25-кратном объеме в ФСБ раствора, после чего использовали для постановки реакции гемагглютинации.

Тест проводили в иммунологическом планшете с U-образными лунками. В каждую лунку предварительно вносили по 50 мкл ФСБ; в первую лунку вносили 50 мкл полученного экстракта. Смесь перемешивали (разведение 1:2). 50 мкл переносили затем из первой лунки во вторую (разведение 1:4) и так далее, до конечного разведения 1:2048. После этого в каждую лунку добавляли по 20 мкл суспензии эритроцитов, смесь перемешивали и оставляли при 4°С, комнатной температуре до наступления гемагглютинации (1-2 ч). В лунках, где произошла агглютинация, осадок эритроцитов имел неправильную форму, а в лунках, где гемагглютинации не было, клеточный осадок образовал компактную точку на дне лунки. Уровень гемагглютинирующей активности выражали в виде титра гемагглютинации − величины наибольшего разведения препарата, все еще дающего четко выраженную агглютинацию. Разведение в последней лунке, в которой происходила гемагглютинация (наименьшее количество лектинов), рассматривался как титр, и этому разведению приписывали значение 1 гемагглютинирующей единицы (ГАЕ). Определение титра гемагглютинации сопровождали контролем на отсутствие спонтанной агглютинации эритроцитов.

Результаты исследований.

Соевое молоко различных компаний-производителей, произведенное из семян сои, а также соевое молоко с дополнительными ингредиентами (сахар, соль) обозначили условно образцами под номерами 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 1`, 2`, 3`, 4`, 5`, 6` соответственно.

В таблице 1 приведены основные характеристики соевого молока всех образцов, а также уровень активности лектинов, который зависит от используемого сырья, степени фильтрации при производстве молока. Оценка геммаглютинирующей активности является относительной.

Таблица 1. Краткая характеристика образцов соевого молока

№	Общий объем, мл	Белок, мг/мл	Соя, %	Геммаглютинирующая активность, титр/мл	Компания
1	200	50.0	9.0	400	Fukuren
2	200	50.0	10.0	6400	Sujyahta
3	200	45.0	8.0	400	Kikkoman (kibun-tounyu)
4	200	51.0	10.0	6400	Marusan (kinusayaka)
5	200	41.0	8.0	400	Kyusyu-nyugyo (midori)
6	125	62.4	14.0	1.6×10^6	Otsuka [-chilled]
1`	200	39.0	7.0	6.5×10^6	Kikkoman
2`	200	37.0	7.0	1.6×10^6	Marusan
3`	200	52.5	9.0	1.02×10^5	Marusan
4`	200	52.5	9.0	400	Yakult
5`	200	38.0	7.0	6.5×10^6	Soyafarm
6`	200	30.5	4.0	1.6×10^6	Soyafarm (toraku)

Как видно из таблицы 1 соевое молоко, содержащее такие ингредиенты как сахар и соль, обладает наибольшей гемагглютинирующей активностью по сравнению с образцами чистого соевого молока.

Следующим этапом исследования являлся проведение коагуляции молока и анализ активности лектинов в выделенных фракциях молока (творожная и сывороточная) на реакцию агглютинации эритроцитов крови.

Разделению на фракции молока подвергались все образцы объемом в 40 мл. В качестве коагулянта использовали раствор хлорид кальция [3]. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2. Гемагглютинирующая активность лектинов соевого молока после коагуляции

N	Фракции
	Сывороточная (SSF)			Творожная (SPF)
	Объем, мл	Белок, мг/мл	HA, Титр/мл (×разведение)	Объем, мл	Белок, мг/мл	HA, Титр/мл (×разведение)
1	27	5.2	400	13	44.8	6.5×10^6
2	23	5.6	-	17	44.4	4.05×10^5
3	23	4.4	-	17	40.6	4.02×10^5
4	23	5.0	1600	17	46.0	1.6×10^6
5	22	4.7	400	18	32.2	4.05×10^5
6	26	11.3	-	14	49.2	1.04×10^8
1`	26	4.9	2.5×10^4	14	34.1	1.04×10^8
2`	26	11.2	2.5×10^4	14	25.8	1.6×10^6
3`	22	7.2	1600	18	45.3	6.5×10^6
4`	23	11.7	-	17	40.8	6.5×10^6
5`	22	7.7	1.02×10^5	18	30.3	6.5×10^6
6`	24	5.5	-	16	25.0	1.04×10^8

Как видно из таблицы 2, наибольшей активностью обладала творожная фракция всех образцов соевого молока. Таким образом, можно сделать вывод о том, что наибольшей гемагглютинирующей активностью обладали образцы соевого молока с дополнительными ингредиентами (сахар, соль), а также творожная фракция молока.

Поскольку лектины являются протеинами, они подвержены процессам дестабилизации и денатурации, таким как нагревание, присутствие кислот, щелочей, окислителей и т.д. В дальнейших исследованиях предполагается провести данные работы.

Автор выражает благодарность Японо-Российскому центру молодежных обменов за помощь в проведении научных исследований.

Список использованных источников:

1. Фитолектины /В.Ф. Корсун, В.М. Лахтин, Е.В. Корсун, А. Мицконас. – М.: Практическая медицина, 2007. – 288 с.

2. Шендеров Б.А. Лахтин В.М. Лектины – новая потенциальная категория физиологически активных функциональных пищевых ингредиентов // Вестник восстановительной медицины, 2004. – № 1. – С. 33-38.

3. Wang C., et al. (2003) Calcium coagulation properties of hydrothermally processed soymilk // JAOCS80, 1225-1229.