Медицина

2. Хирургия

Волков А. Г., д.м.н. Косарева П. В.

Пермская государственная медицинская академия имени академика Вагнера

Антибактериальное действие низкомолекулярного пептидного комплекса из лейкоцитов человека в отношении условно-патогенных микроорганизмов – возбудителей абдоминальных инфекций у человека

Одной из актуальных проблем ургентной хирургии до сих пор является острый перитонит; разработка и апробация новых методов его лечения традиционно происходит в условиях эксперимента [5].

В настоящее время в литературе описано большое количество экспериментальных моделей перитонита, которые можно отнести к пяти группам: введение в брюшную полость инородных тел, химических веществ, введение чистых культур микроорганизмов, механическое повреждение желудочно-кишечного тракта, введение в брюшную полость взвеси кала животных [4]. Недостатком всех описанных моделей является отсутствие четкой клинической картины и фазности течения перитонита.

В последнее десятилетие формирование антибиотикорезистентных форм микроорганизмов диктует необходимость поиска новых средств терапии инфекционно-воспалительных заболеваний. Благодаря ярко выраженным антимикробным свойствам и небольшому размеру молекул, пептидные комплексы рассматриваются как потенциальные агенты для лечения инфекционных заболеваний человека. Несомненными преимуществами антимикробных пептидов перед традиционными антибиотиками являются более широкий спектр антибактериального действия, функциональная активность при малых концентрациях, практически полное отсутствие возможности формирования резистентности возбудителей к антимикробным пептидам, возможность синтеза аналогов природных пептидов с измененными биологическими свойствами. Тем не менее, использовать в медицине в качестве антибактериальных препаратов можно лишь те пептиды, которые не вызывают иммунный ответ клеток млекопитающих, в том числе и человека. Поэтому применение синтетических пептидов вызывает определенные опасения, в частности, вследствие возможной ответной реакции организма на чужеродное вещество. Из вышеуказанного следует, что для лечения человека предпочтительнее использовать натуральные антибактериальные пептиды и пептидные комплексы – во избежание ответных реакций со стороны иммунной системы.

Таким образом, в сложившихся условиях актуальным и своевременным становится поиск новых лекарственных средств терапии абдоминальных инфекций, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, и апробация их в доклинических и клинических исследованиях.

Целью работы явилось исследование в экспериментах in vitro антибактериального действия низкомолекулярного пептидного комплекса, продуцируемого лейкоцитами человека в процессе интерфероногенеза, в отношении штаммов условно-патогенных микроорганизмов, наиболее часто являющихся возбудителями абдоминальной инфекции у человека.

Материалы и методы.

В Пермском НПО «Биомед» из полуфабрикатов интерферона получен низкомолекулярный катионный пептидный комплекс с молекулярной массой ниже 5 кДа [1]. Для проведения исследований отобрано 10 образцов пептидсодержащего материала. Каждый образец был разделен на 5 фракций, первые две из них отбирались для оценки антибактериальной активности.

Учитывая проведенные нами ранее исследования сравнительного мониторинга распределения микроорганизмов в экссудатах больных абдоминальной инфекцией, ведущим этиологическим фактором на сегодняшний день остается Escherichia coli: ее доля в структуре абдоминальных микроорганизмов составляет не менее 40%; значимы в этиологическом плане также микроорганизмы рода Staphylococcus (от 8,33% до 42,86%) и вида Pseudomonas aeruginosae (около 10%) [2]. В связи с этими данными проведено исследование в условиях in vitro антибактериального действия низкомолекулярного пептидного комплекса, продуцируемого лейкоцитами человека в процессе интерфероногенеза, в отношении штаммов условно-патогенных микроорганизмов (59 культур) - бактерий родов Staphylococcus, Escherichia, Klebsiella и Proteus, выделенных от больных с микробно-воспалительными заболеваниями.

Готовили серии двойных разведений низкомолекулярного катионного пептидного комплекса из лейкоцитов человека – объем 100 мкл, активность – 4000-8000 УЕ/мл против референтного штамма Staphylococcus epidermidis (в разведении 1: 4000 регистрировалось антибактериальное действие пептидного комплекса) – в лунках планшета для иммунологических реакций (Санкт-Петербургский завод медицинских полимеров), используя для разведения 100 мкл мясопептонного бульона. Суточные бульонные культуры микроорганизмов брали в исследование в концентрации 1*10⁶ и 1*10⁷ колониеобразующих единиц в 1,0 мл, что соответствовало их оптической плотности, определяемой на фотоэлектрическом фотометре КФК-3 при длине волны 540 нм, 0,0015 и 0,015, поскольку по требованиям National Committee for Clinical Standards, 1993 (США), при определении минимальной подавляющей концентрации антибактериальных препаратов используется концентрация 10⁶ колониеобразующих единиц в 1,0 мл. Культуру вносили в лунки планшета в объеме 10 мкл и инкубировали в термостате в течение 18-24 часов при температуре 37 ºС. По истечении срока инкубации осуществляли регистрацию результатов. Отсутствие роста в лунках планшета расценивали как проявление антибактериального действия катионного пептидного комплекса в отношении тестируемой культуры в соответствующем разведении препарата. Результаты исследований подвергнуты статистической обработке с применением приложения Microsoft ^® Excel полнофункционального офисного пакета Microsoft Office 2007.

Исследования антибактериальной активности пептидного комплекса проведены на базе лаборатории биохимии развития микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (г. Пермь) под руководством заведующего лабораторией кандидата медицинских наук В. П. Коробова.

Результаты и обсуждение.

К антибактериальному действию пептидного комплекса из лейкоцитов человека чувствительны 83,1 % протестированных штаммов. Примечательно, что для прекращения роста 81,36 % патогенов достаточно действия пептидного комплекса в концентрации 4000 УЕ/мл. Только небольшая часть исследуемых микроорганизмов (1,7%) проявила чувствительность к антибактериальному пептидному комплексу в концентрации 8000 УЕ/мл. Прочие протестированные культуры (16,9%) к катионному пептидному комплексу из лейкоцитов человека либо нечувствительны, либо их чувствительность лежит в области более высоких (выше 16000 УЕ/мл) концентраций препарата.

Известно, что катионные антибактериальные пептиды более активны в отношении грамположительной, нежели грамотрицательной микрофлоры. Проанализирована антибактериальная активность тестируемого пептидного комплекса в отношении грамположительных микроорганизмов (стафилококков) и грамотрицательных микроорганизмов, принадлежащих родам Escherichia, Klebsiella, Proteus.

Выявлено, что при концентрации пептидного комплекса 4000 УЕ/мл 100% протестированных стафилококков прекращают рост в мясо-пептонном бульоне. При этой же концентрации (4000 УЕ/мл) инактивируются только 78,5% грамотрицательных микроорганизмов, 19,6% грамотрицательной микрофлоры резистентно к действию пептидного комплекса.

По результатам проведенных исследований можно сделать вывод о том, что грамположительные микроорганизмы в значительной степени более чувствительны к антибактериальному действию катионного пептидного комплекса, нежели грамотрицательные микроорганизмы, что подтверждает литературные данные относительно того, что антибактериальное действие катионных пептидов в первую очередь реализуется в отношении грампозитивной флоры [3].

Мы также проанализировали более детально чувствительность к пептидному комплексу всех представителей грамнегативной флоры – бактерий родов Escherichia, Klebsiella и Proteus.

Большинство патогенов вида Escherichia coli чувствительны к пептидному комплексу в концентрации 4000 УЕ/мл. Тем не менее, 13% эшерихий резистентны к действию катионного пептидного комплекса, и эта резистентность не зависит от использованных в нашем опыте его концентраций.

Для прекращения роста 80% культур бактерий рода Klebsiella достаточно относительно низкой концентрации пептидного комплекса (2 000 УЕ/мл). Дальнейшее увеличение концентрации пептидного комплекса приводит к незначительному росту числа чувствительных к пептидному комплексу клебсиелл – при концентрации 4000 УЕ/мл их становится 86,67%. Так же, как и при тестировании эшерихий, видно, что дальнейшее увеличение концентрации пептидного комплекса не дает увеличения числа чувствительных к нему штаммов.

Бактерии рода Proteus оказались наиболее резистентны к антибактериальному действию пептидного комплекса – к нему были нечувствительны 38,5% штаммов этого рода. Однако подавляющее большинство микроорганизмов (54%) проявляли чувствительность при относительно низкой концентрации пептидного комплекса – в интервале от 1000 до 2 000 УЕ/мл.

Выводы.

Наиболее часто встречающиеся представители условно-патогенной микрофлоры (как грамположительной, так и грамотрицательной) чувствительны к катионному пептидному комплексу в среднем в 83% случаев. Это дает нам право дальнейшего изучения его свойств, проведения доклинических экспериментов с целью создания в перспективе на его основе эффективного антибактериального препарата нового поколения, лишенного побочных эффектов химически синтезированных антибиотиков. Кроме того, можно предполагать наличие у пептидного комплекса из лейкоцитов человека иммуномодулирующих свойств, поскольку многие антибактериальные пептиды являются одновременно многофункциональными иммуномодуляторами.

Работа выполнена в рамках Госзадания ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия имени академика Е.А. Вагнера» Минздрава России «Экспериментальное моделирование и патогенетическая терапия инфекционно-воспалительных заболеваний в эксперименте»; УДК: 616.9-085-092.9 (470.53-25); № госрегистрации: 0120.0800814.

Литература

1. Volkova, L. V. Physico-chemical characterization of low molecular weight peptide complex associated with interferon / L. V. Volkova // Siberian Journal of Medicine. – 2004. – Vol.19, № 2. – P. 53-55.

2. Volkov, A. G. Microbial landscape in patients with abdominal surgical infection / A. V. Volkov // Student and scientific and technological progress: Theses. Reports. 51th Intern. Scientific. studench. Conf. : Novosibirsk, 2013. – Р. 61.

3. Kokryakov, V. N. Biology of animal antibiotics. St. Petersburg : Nauka, 1999. – 152 р.

4. Lazarenko, V. A. The experimental model of common fecal peritonitis / V. A. Lazarenko // Kursk scientific and practical Gazette : The Man and his health. – 2008. – P. 128-132.

5. Flight B. A. The method of modeling of acute peritonitis in rats / B. A. Flight, A. B. Flight // Patent №2427925, Russia, 26.02.2010.