Биологические науки/ 6. Микробиология

Аспирант Шишин М.В.

ФГБОУ ВПО «КемТИПП»

Д.т.н. Бабич О.О.

ФГБОУ ВПО «КемТИПП»

Аспирант Зимина М.И.

ФГБОУ ВПО «КемТИПП»

К.т.н. Сухих С.А.

ФГБОУ ВПО «КемТИПП»

К.т.н. Милентьева И.С.

ФГБОУ ВПО «КемТИПП»

Скрининг микроорганизмов различных таксономических групп, выделенных из желудочно-кишечного тракта человека, проявляющих пробиотические свойства

Желудочно-кишечный тракт представляет собой одну из наиболее сложных микроэкологических сред организма человека, в которой на суммарной площади слизистой оболочки, составляющей около 400 м, имеется исключительно высокая и разнообразная (свыше 500 видов) плотность микробной обсеменённости, в которой очень тонко сбалансировано взаимодействие между защитными системами организма и микробными ассоциациями. Бактерии составляют от 35 до 50% объёма содержимого ободочной кишки человека, а их совокупная биомасса в желудочно-кишечном тракте приближается к 1,5 кг.

Желудочно-кишечный тракт – это комплексная экосистема, которая представлена ассоциацией резидентной микробиоты и клетками различных фенотипических линий эпителиальной стенки. Термин микробиота, предложенный Savage D.С., представляет собой коллективное сообщество бактерий на слизистых оболочках каждого индивидума. Взаимно дополняя друг друга, организм и сопровождающие его бактерии образуют единую симбиотическую систему. При этом организм представляет не только среду обитания, находясь в состоянии динамического равновесия с собственной микрофлорой, но и является частью этой системы.

Млекопитающие изначально рождаются стерильными. Колонизация гастроинтестинального тракта начинается сразу же после рождения. Первые бактерии, колонизирующие кишечник, попадают из родовых путей и включают аэробные и анаэробные бактерии, такие как Escherichia coli, Clostridium spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Bacteroides spp. и Bifidobacterium spp.

Резидентная микрофлора пищеварительного тракта – это гетерогенная микробная экосистема, которая содержит до 1·10¹⁴ КОЕ бактерий. Микробиота на протяжении всего желудочно-кишечного тракта отличается по видовым и количественным характеристикам, заселяет различные биотопы человеческого организма, включающие в себя полости рта, носа, глотки, кожу, кишечный и вагинальный тракты. Желудок из-за низкого рН является плохо колонизируемым органом, микрофлора которого включает в себя в основном лактобациллы, стрептококки и дрожжевые грибы в количестве 10³ КОЕ на грамм содержимого (КОЕ/г). Helicobacter pylori в желудке встречается только в определённых географических регионах мира. Двенадцатиперстная кишка или начальный отдел тонкого кишечника также имеет низкую популяцию микроорганизмов из-за быстрого транзита содержимого через неё, а также благодаря панкреатическому секрету, создающему для микробов неблагоприятную среду. По ходу тонкого и тощего кишечника наблюдается значительное увеличение видового и количественного состава микрофлоры, который в среднем составляет 10⁴-10^6-7 КОЕ/г в области илеоцекального угла. Основными механизмами, препятствующими их росту в тонкой кишке, являются антибактериальное действие желчи; кишечная перистальтика, обеспечивающая быстрый пассаж микроорганизмов в дистальный отдел кишечника, выделение в просвет кишки из её стенки иммуноглобулинов; ферментативная активность нормофлоры; состояние

кишечного эпителия и слизи, выделяемой бокаловидными клетками кишечника, содержащей ингибиторы роста микроорганизмов. При нарушении указанных механизмов нарастает микробное обсеменение тонкой кишки.

Толстый кишечник – наиболее густо заселённая область желудочно-кишечного тракта, включающая в себя микрофлору в концентрации 10¹¹ КОЕ/г кишечного содержимого. Данная область обеспечивает лучший бактериальный рост с низким временем транзита, наличие готовых питательных веществ и благоприятную рН. У женщин микрофлора, населяющая влагалище, составляет 10^7-8 КОЕ/мл содержимого с преобладанием штаммов лактобацилл у здоровых субъектов и патогенной микрофлоры у больных с инфекционным процессом.

Микробный профиль пищеварительного тракта характеризуется отсутствием анаэробных микроорганизмов в желудке и подавляющим большинством их в дистальных отделах толстого кишечника. Различные микробные сообщества могут находиться в просвете кишечника, в слизи, покрывающей эпителий, в пространстве между криптами или в различных клетках, покрывающих эпителий, а некоторые виды прикрепляются в нетипичных местах. Число бактериальных видов кишечной микробиоты насчитывает около 1000. Желудочно-кишечную микробиоту составляют аэробные, факультативно-анаэробные и анаэробные бактерии. Соотношение анаэробной и аэробной микрофлоры увеличивается с преобладанием анаэробов от проксимального к дистальному отделу кишечника. Микробиота толстого кишечника на 99% представлена анаэробами. Только 10% штаммов, выделенных из желудочно-кишечного тракта, могут быть культивированы и охарактеризованы. В настоящее время с помощью молекулярно-генетических методов исследования, основанных на определении 16S гРНК или гДНК, и технологических инноваций, например, использование селективных питательных сред, становится возможным вырастить и изучить ранее не культивируемые виды.

Каждый индивид обладает внутривидовыми и внутриродовыми вариациями микробного состава. Например, фекальная микробиота детей представлена меньшим видовым и количественным составом, а с возрастом наблюдается уменьшение количества бифидобактерий и увеличение бактероидов. Возрастные изменения могут привести к изменению метаболической активности кишечной микробиоты, что предрасполагает к развитию заболеваний.

Кишечная микробиота играет важную роль в нормальном функционировании кишечника и поддержании здоровья организма. Достаточно изучено, как члены индигенной микробиоты функционируют с организмом для достижения положительных симбиотических связей. Hooper, L.V. и его сотрудники объясняют это взаимодействие наличием перекрестной связи между эпителиальными клетками и микробиотой. В частности, внутрипросветная микробиота влияет на освобождение биологически активных желудочно-кишечных пептидов и способствует регулированию работы гастроинтестинальных эндокринных клеток и эпителиальных структур. Колонизация мышей – гнотобиотов представителем кишечной флоры Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482 выявила, что этот комменсал регулирует экспрессию генов, контролирующих важные кишечные функции, включая абсорбцию нутриентов, укрепление слизистого барьера, ксенобиотический метаболизм, ангиогенез и постнатальное кишечное развитие. Имеются сообщения о влиянии микробов комменсалов на развитие гуморального и клеточного иммунитета в течение неонатального периода жизни человека, а также на сохранение физиологически нормального стабильного уровня воспаления.

Бактерии рода Lactobacillus обнаруживают на протяжении всего желудочно-кишечного тракта, но состав микробиоты меняется в зависимости от возраста и периодов жизни. Лактобациллы принадлежат к молочнокислым бактериям, т. к. конечным продуктом их углеводного обмена является молочная кислота. Род Lactobacillus включает в себя большую гетерогенную группу грамположительный неспорообразующих анаэробных бактерий. Таксономически род Lactobacillus принадлежит к типу Firmicutes, классу Bacilli, порядку Lactobacillales, семейству Lactobacillaсеае. Близкородственные микроорганизмы рода Paralactobacillus и Pediococcus также относятся к семейству Lactobacillaceae. Род Lactobacillus является наиболее многочисленным родом порядка Lactobacillales и включает в себя 106 описанных видов. Очень тяжело отличить аутохтонные лактобациллы от аллохтонных, транзиторных лактобацилл, выделенных, например, из продуктов питания или ротовой полости, являющейся местом обитания большинства лактобацилл. Лактобациллы составляют небольшую долю от всей кишечной микробиоты – от 0,01% до 0,6%.

L. gasseri, L. reuteri, L. crispatus, L. salivarius, L.ruminis являются предоминантными аутохтонными штаммами лактобацилл. L. acidophilus, L. fermentum, L. casei, L.rhamnosus, L. johnsonii, L. plantarum, L. brevis, L. delbrueckii, L. curvatus, L. sakei также присутствуют в желудочно-кишечном тракте, но их состав постоянно меняется. Несмотря на то, что лактобациллы выделяют из биоптатов желудка, тонкого и толстого кишечника, их количество достаточно вариабельно и ниже реальных цифр. По сравнению со взрослыми микробиота детей очень нестабильная, но также содержит лактобациллы в вариабельных количествах. Количество лактобацилл у новорожденных составляет 10⁵ КОЕ/г фекалий, в то время как у детей 1 месяца и старше их уровень колеблется от 10⁶ до 10⁸ КОЕ/г фекалий. У детей выделяются L. salivarius, L. rhamnosus, L. paracasei.

Лактобациллы являются грамположительными неспорообразующими микроорганизмами, принимающим форму как палочек, так и коккобацилл. Это микроаэрофилы, хемоорганотрофы, требующие обогащенную среду для роста, каталазоотрицательные, хотя у некоторых штаммов встречается псевдокаталазная активность. В основе генома лежит ДНК, содержание Г+Ц – 54 мол%. В окружающей среде лактобациллы встречаются повсюду, где углеводы находятся в доступном состоянии, например в продуктах питания (молочные изделия, мясо, тесто, овощи, фрукты, напитки), респираторном, желудно-кишечном и половом тракте человека и животных, а также в сточных водах и растительных материалах. Состав филогенетических групп лактобацилл представлен в таблице 1.

Таблица 1 – Филогенетические группы лактобацилл

№	Группы	Виды
1	L. delbrueckii (delb)	L. acetotolerans, L. acidophilus, L. amylolyticus,
2	L. salivarius (sal)	L. amylophilus, L. amylotrophicus, L. amylovorus, L. crispatus,
3	L. reuteri (reu)	L. delbrueckii, L. fornicalis, L. gallinarum, L. gasseri,
4	L. buchneri (buch)	L. hamsteri, L. helveticus, L. iners, L. intestinalis, L.jensenii,
5	L. alimentarius	L. johnsonii, L. kalixensis, L. kefiranofaciens, L. kitasatonis,
6	L. farciminis (al-far)	L. psittaci, L. sobrius, L.ultunensis
7	L. casei(cas)	L. acidipiscis, L. agilis, L. algidus, L. animalis, L. apodemi,
8	L. sakei (sakei)	L. aviarius, L. equi, L. mali, L. murinus, L. nageli, L. ruminis,
9	L. fructivorans (fru)	L. saerimneri, L. salivarius, L. satsumensis, L. vini
10	L. plantarum (plan)	L. plantarum, L. paraplantarum, L. pentosus
11	L. perolens (per)	L. perolens, L. harbinensis, paracollinoides
12	L. brevis (bre)	L. brevis, L. hammesii, L. parabrevis
13	Pediococcus dextrinicus	P. dextrinicus, L. concavus, L. oligofermentans
14	P(dex)	2 не связанных кластера: первый включает P. cellicola, Р.
15	Pediococcus	damnosus, P. parvulus, P. inopinatus; второй - P. acidilactici,
16	Пары	P. claussenii, P. pentosaceus и P. stilesii

Таблица 2 – Фенотипические свойства микроорганизмов, выделенных из желудочно-кишечного тракта здоровых людей и больных онкологическими заболеваниями

Род микроорганизмов	Размер	Форма	Характер конкура края		Рельеф	Поверхность	Цвет	Условия культивирования
Лактозоположительные энтеробактерии, рода Escherichia, Klebsiella, Enterobacter	1-2 мм	Колонии S-формы	Ровный		Выпуклый	Гладкая	Красные с металлическим блеском	t=37°С, аэробный режим в течение 24-48 ч
Лактозоотрицательные энтеробактерии, рода Proteus, Salmonella, Shigella, Citrobacter, Serratia	1-2 мм	Колонии S-формы	Ровный		Выпуклый	Гладкая	Бесцветные	t=37°С, аэробный режим в течение 24-48 ч
Бактерии рода Pseudomonas	1-2 мм	Колонии S-формы	Ровный		Выпуклый	Гладкая	Зеленоватые флюоресцирующие, выделяющие в среду сине-зелёный пигмент	t=37+5°С, аэробный режим в течение 24-48 ч
Бактерии рода Staphylococcus	2-4 мм	Колонии S-формы	Ровный		Выпуклый	Гладкая	Мутные, желтоватого цвета	г=37°С, аэробный режим в течение 24-48 ч
Бактерии рода Micrococcus	1-2 мм	Колонии S-формы	Ровный		Выпуклый	Гладкая	Бежево-коричневые	t=37°С, аэробный режим в течение 24-48 ч
Бактерии рода Peptococcus	1 мм	Колонии S-формы	Ровный		Выпуклый	Блестящая	Серого цвета	t=37°С, аэробный режим в течение 24-48 ч
Бактерии рода Sarcina	2-4 мм	Колонии S-формы	Ровный		Выпуклый	Матовая	Лимонно-желтого цвета	t=37°С, аэробный режим в течение 24-48 ч
Бактерии рода Enterococcus	0,5-1,0 мм	Колонии S-формы	Ровный		Выпуклый	Гладкая	Мутные, сероватого цвета	t=37°C, аэробный режим в течение 24-48 ч
Бактерии рода Streptococcus	1-2 мм	Колонии S- или R-формы	Неровный		Выпуклый	Матовая	Серого цвета	t=37°C, аэробный режим в течение 24-48 ч
Бактерии рода Peptostreptococcus	1 мм	Колонии S-формы	Ровный		Выпуклый	Блестящая	Коричневого цвета	t=37°C, аэробный режим в течение 24-48 ч
Дрожжеподобные грибы рода Candida	1-2 мм	Колонии S-формы	Ровный	Выпуклый		Гладкая	Беловато-кремового цвета	t=37°C, аэробный режим в течение 24-48 ч
Дрожжеподобные грибы рода Cryptococcus	2 мм	Колонии R-формы	Ровный	Выпуклый		Гладкая	Кремово-коричневого цвета	t=37°C, аэробный режим в течение 24-48 ч
Бактерии рода Actinomyces	2 мм	Колонии S- или R-формы	Ровный	Выпуклый		Гладкая	Бесцветные	t=37°C, аэробный режим в течение 24-48 ч
Бактерии рода Neisseria	1-2 мм	Колонии S-формы	Ровный	Выпуклый		Гладкая	Мутные, бесцветные	t=37°C, аэробный режим в течение 24-48 ч
Бактерии рода Acinetobacter	2-3 мм	Колонии S-формы	Ровный	Выпуклый		Гладкая	Серовато-белого цвета	t=37°C, аэробный режим в течение 24-48 ч
Бактерии рода Могахella	0,5-1,0 мм	Колонии S-формы	Ровный	Выпуклый		Гладкая	Прозрачные	t=37°C, аэробный режим в течение 24-48 ч
Бактерии рода Bacillus	1-2 мм	Колонии S- или R-формы	Ровный	Выпуклый		Гладкая	Мутные, серовато-коричневого цвета	г=37°С, аэробный режим в течение 24-48 ч
Бактерии рода Bacteroides	1-2 мм	Колонии S-формы	Ровный	Выпуклый		Гладкая	Жемчужно-серого цвета	t=37°C, анаэробный режим в течение 24-48 ч
Бактерии рода Fusobacterium	1 мм	Колонии S-формы	Ровный	Выпуклый		Гладкая	Желтоватого цвета	t=37°C, анаэробный режим в течение 24-48ч
Бактерии рода Bifidobacterium	1 мм	Колонии S-формы	Ровный	Выпуклый		Гладкая	Черного цвета	t=37°C, анаэробный режим в течение 24-48 ч
Бактерии рода Eubacterium	1 мм	Колонии S-формы	Ровный	Выпуклый		Гладкая	Серого цвета	t=37°C, анаэробный режим в течение 24-48 ч
Бактерии рода Clostridium	1-2 мм	Колонии S-формы	Ровный	Выпуклый		Гладкая	Серого цвета	t=37°C, анаэробный режим в течение 24-48 ч
Бактерии рода Campylobacter	1-2 мм	М-формы	Расползающийся	Выпуклый		Влажная	Сероватого цвета	t=37°C, микроаэ- рофильный режим в течение 24-48 ч
Бактерии рода Helicobacter	1 мм	Колонии S-формы	Ровный	Выпуклый		Гладкая, блестящая	Прозрачные	t=37°C, микроаэ- рофильный режим в течение 24-48 ч
Бактерии рода Leptotrichia	1-2 мм	Колонии S-формы	Ровный	Выпуклый		Гладкая	Серого цвета	t=37°C, анаэробный режим в течение 24-48 ч
Бактерии рода Prevotella	1 мм	Колонии S-формы	Ровный	Выпуклый		Гладкая, блестящая	Коричнево-черного цвета	t=37°C, анаэробный режим в течение 24-48 ч.

Пр

На первом этапе реализации проекта выделяли микроорганизмы из фекалий здоровых людей разных возрастных групп и больных онкологическими заболеваниями желудочно-кишечного тракта (образцы получены от пациентов из Российской Федерации). Для выделенных микроорганизмов изучали фенотипические, морфологические и пробиотические свойства. Результаты анализа фенотипических свойств микроорганизмов, выделенных из желудочно-кишечного тракта здоровых людей и больных онкологическими заболеваниями, представлены в таблице 2.

Из таблицы 2 следует, что в фекалиях здоровых людей и больных онкологическими заболеваниями желудочно-кишечного тракта присутствуют бактерии следующих родов: Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Salmonella, Shigella, Citrobacter, Serratia, Pseudomonas, Staphylococcus, Micrococcus, Peptococcus, Sarcina, Enterococcus, Streptococcus, Peptostreptococcus, Actinomyces, Neisseria, Acinetobacter, Могахella, Bacillus, Bacteroides, Fusobacterium, Bifidobacterium, Eubacterium, Clostridium, Campylobacter, Helicobacter, Leptotrichia, Prevotella. Также из желудочно-кишечного тракта человека выделены дрожжеподобные грибы родов Candida и Cryptococcus.

Литература:

1. Механизмы реализации метаболической и специфической противоопухолевой активности нового противоопухолевого препарата деглутам / Л.И. Нефедов, И.О. Леднева, А.В. Каравай, А.А. Глазев и др. // Лабораторная диагностика Восточная Европа. - 2012. - № 1. - С. 66-71.

2. Пат. 2007134338 Российская Федерация, МПК C12N9/10. Полиэпитопный пептид иммунологической и противоопухолевой активностью, полученный из тимидилатсинтазы / П. Корреале, М. Кузи, Г. Франчини и др.; заявитель и патентообладатель Университа Дельи Студи Ди Сиена. - №2007134338/13; заявл. 15.02.2006; опубл. 27.03.2009.

3. Пат. 2008120665 Российская Федерация, МПК C07K14/47. Совместная химиотерапия и иммунотерапия / Д. Сэмпсон, Д. Бигнер, Э. Хаймбергер и др.; заявитель и патентообладатель Дьюк Юниверсити, Юниверсити Оф Техас М.Д.Андерсон Кэнсер Сентер. - №2008120665/13; заявл. 02.11.2006; опубл. 27.11.2009.

4. Пат. 2357973 Российская Федерация, МПК C07K5/062. Способ получения дипептидов лупанового ряда / У.М. Джемилев, Г.А. Толстиков, С.В. Сысолятин и др.; заявитель и патентообладатель Институт нефтехимии и катализа Российской академии наук. - №2007135691/04; заявл. 26.09.2007 ; опубл. 10.06.2009.

5. Пат. 2362579 Российская Федерация, МПК A61K38/06. Фармацевтическая композиция на основе пептида, обладающего противоопухолевым действием / В.Х. Хавинсон, Г.А. Рыжак, Л.В. Козлов ; заявитель и патентообладатель Общество с ограниченной ответственностью «СИА Пептайдс». - №2007143338/15 ; заявл. 26.11.2007 ; опубл. 27.07.2009.