Биологические науки/ 6. Микробиология
Д.т.н. Бабич О.О.
ФГБОУ ВПО «КемТИПП»
К.б.н. Дышлюк Л.С.
ФГБОУ ВПО «КемТИПП»
Д.т.н Просеков А.Ю.
ФГБОУ ВПО «КемТИПП»
Аспирант Асякина Л.К.
ФГБОУ ВПО «КемТИПП»
Изучение антимикробной активности
белковых веществ, выделенных из микроорганизмов
Бактериоцины – это антибактериальные
вещества белковой природы, вырабатываемые бактериями и подавляющие
жизнедеятельность других штаммов того же вида или родственных видов.
Способностью к синтезу бактериоцинов обладают как грамположительные, так и
грамотрицательные бактерии. Исследователи рассматривают бактериоцины в качестве
потенциальных антимикробных лекарственных веществ и консервантов, подавляющих
рост и развитие патогенных и условно патогенных бактерий и дрожжевых грибов. Известно,
что антибиотики оказывают многочисленные побочные действия, негативно
сказывающиеся на организме человека, в то же время бактериоцины и продуцирующие
их штаммы посредством избирательного воздействия на микрофлору нормализуют
микробный ценоз при некоторых патологиях у человека и животных [1].
Интерес к
использованию бактериоцинов, образуемых лактококками, резко возрос. Одним из
главных аспектов этого интереса является возросший спрос потребителей к
качеству продуктов питания и их безопасности для здоровья, поскольку широко используемые
химические консерванты и некоторые антибиотики, увеличивающие срок хранения продуктов
питания, вызывают опасения [1, 3].
Синтез бактериоцинов – наследственная
особенность микроорганизмов, проявляющаяся в том, что каждый штамм способен
образовывать один или несколько определенных, строго специфичных для него
антибиотических веществ. Бактериоцины
осуществляют естественное предохранение пищевых продуктов, в том числе
полученных путем ферментации. Продуцирующие бактериоцины штаммы микроорганизмов,
в частности молочнокислые бактерии, или сами бактериоцины могут быть использованы
как природные консерванты пищевых продуктов. Задача состоит в том, чтобы
оптимизировать продуцирование бактериоцинов бактериями, повысить активность и
стабильность этих соединений, направленно получать бактериоцины с заданными
свойствами [2].
Результаты определения антимикробной активности пяти
выделенных белковых фракций приведены в таблице 1.
Таблица 1 – Результаты определения антимикробной
активности белковых метаболитов микроорганизмов, выделенных с поверхности
свежих овощей
|
Тест-культура |
Номер белковой фракции |
||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
|
|
Диаметр зон ингибирования роста, мм |
||||
|
Pseudomonas fluorescens - |
0 |
0 |
11,7±0,6 |
0 |
16,6±0,8 |
|
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 - |
0 |
0 |
13,3±0,7 |
0 |
0 |
|
Candida albicans |
0 |
0 |
0 |
0 |
17,8±0,9 |
|
Leuconostoc mesenteroides + |
10,5±0,5 |
0 |
7,6±0,4 |
0 |
11,5±0,6 |
|
Arthrobacter cumminsii + |
13,4±0,7 |
0 |
12,8±0,6 |
0 |
15,4±0,8 |
|
Alcaligenes faecalis- |
0 |
0 |
18,5±0,9 |
0 |
21,0±1,0 |
|
Escherichia coli ATCC 25922 - |
0 |
0 |
13,3±0,7 |
0 |
12,8±0,6 |
|
Enterobacter ludwigii - |
0 |
0 |
15,0±0,8 |
0 |
14,5±0,7 |
|
Erwinia aphidicola- |
0 |
0 |
8,8±0,4 |
0 |
0 |
Micrococcus
luteus+ |
17,0±0,9 |
0 |
14,2±0,7 |
0 |
16,0±0,8 |
|
Salmonella enterica- |
0 |
0 |
19,3±1,0 |
0 |
18,3±0,9 |
|
Listeria monocytogenes+ |
15,2±0,8 |
0 |
16,1±0,8 |
0 |
17,7±0,9 |
|
Yersinia spp.- |
0 |
0 |
0 |
0 |
12,8±0,6 |
|
Staphylococcus aureus+ ATCC 25923 |
16,0±0,8 |
0 |
20,1±1,0 |
0 |
16,5±0,8 |
Из таблицы 1 следует, что антимикробными свойствами
обладают только метаболиты №1, №3 и №5. Фракции №2 и №4 не проявляют
антимикробной активности в отношении исследуемых тест-штаммов, следовательно,
не являются бактериоцинами. Данные таблицы 5.3.3 также свидетельствуют о том,
что фракция №1 активна только в отношении грамположительных бактерий, в то
время как фракции №3 и №5 характеризуются широким спектром антимикробного
действия: грамположительные и грамотрицательные бактерии, а также
микроскопические грибы.
Для идентификации белковых компонентов,
обладающих антимикробными свойствами, использовали метод
хромато-масс-спектрометрии MALDI-TOF. Масс-спектры белковых
фракций №1, №3 и №5 представлены на рисунке 1, молекулярная масса и аминокислотные
последовательности - в таблице 2.
В
ходе исследований выявлено, что компонент №1 составляет основную массу бактериоцина (выход 3,0 г/л), имеет молекулярную массу и аминокислотную
последовательность, идентичные данным величинам для низина, проявляет
антимикробное действие только по отношению к грамположительным бактериям,
хорошо растворим в воде, мало растворим
в этаноле и эфире. В этой связи сделан вывод о том, что компонент №1 является
низином.
Таблица
2 – Физико-химические и биологические свойства метаболитов, синтезируемых
микроорганизмами, выделенными с поверхности овощей
|
Свойство |
Компоненты бактериоцинподобного комплекса |
Низин |
|||
|
№1 |
№3 |
№5 |
|||
|
Выход, г/л |
3,0 |
0,8 |
2,1 |
- |
|
|
Молекулярная
масса
|
3353 |
6039 |
9975 |
3353 |
|
|
Аминокислотная последовательность |
ITSISLCTPGCKTGALMGCNMKTATCHCSIHVSK |
ERLEELNVPGEIVESLSSSEESITRFQSEEQQTEDELQDKIHPFAQTQSLVYPFPGPIHNSLPQYPVE |
LPLLQSWMHQPHQPLPPWVMFPPQSVLSLSQSKEAMAPKDMPILYQEPVLGPVRYPVEPFTESQSLTLTDVENLHLPNIPPLTPVVVPPFLQPEVMGVSKIHPFAQTQSLVYP |
ITSISLCTPGCKTGALMGCNMKTATCHCSIHVSK |
|
|
Растворимость |
Хорошо растворим в воде, мало растворим в этаноле и эфире. |
Растворим в н-бутаноле, этилацетате, водном ацетонитриле;
не растворим в этаноле, воде
|
Растворим в хлороформе, ацетонитриле, н-бутаноле; не
растворим в воде, водном этаноле. |
Хорошо растворим в воде, мало растворим в этаноле
и эфире. |
|
Анализ физико-химических и
биологических свойств фракций №3 и №5 не позволил выявить их принадлежность ни
к одному из описанных на данный момент бактериоцинов. Тем не менее, данные
фракции обладают широким спектром антимикробного действия и, возможно, являются
новыми биологически активными веществами.
|
|
|
|
а |
б |
|
в |
Рисунок 1 – Масс-спектры белковых фракции: а – фракция №1, б – фракция №3, в – фракция №5 |
Соответствие компонента №1
бактериоцинподобного комплекса низину также подтвержали с помощью
обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ). Из рисунка
2 следует, что компонент №1 по времени выхода на ОФ-ВЭЖХ совпадает с
аналогичной характеристикой бактериоцина низина, что дополнительно подтверждает,
что идентифицированный компонент является низином.
|
|
|
|
а |
б |
|
Рисунок 2– ОФ-ВЭЖХ-хроматограмма компонента №1
бактериоцинподобного комплекса (а), синтезируемого микроорганизмами овощей, и
стандартного препарата низина (б) |
|
Таким образом, в составе метаболитов,
продуцируемых микроорганизмами, находящимися на поверхности свежих овощей,
выделены пять белковых фракций: №1-5. Установлено, что фракции №2 и №4 не
проявляют антимикробной активности, следовательно, не являются бактериоцинами.
Экспериментальными исследованиями подтверждено, что фракция №1 представляет
собой низин. Фракции №3 и №5 характеризуются широким спектром антимикробной
активности, но не принадлежат ни к одному из описанных на данный момент
бактериоцинов. Фракции №1, №3 и №5 войдут в состав разрабатываемого
биоконсерванта для продления сроков хранения овощей и фруктов.
Литература:
1. Червинец, Ю.В., Бондаренко В.М., Шабанова
Н.А. Бактериоциногенные
высокоантагонистические штаммы лактобацилл / Ю.В. Червинец, В.М. Бондаренко,
Н.А. Шабанова // Микробиология. - 2006. - №7. - 43.
2. Benkerroum,
N. Isolation of a bacteriocin-producing Lactococcus lactis subsp. lactis and
application to control Listeria monocytogenes in Moroccan jben / N. Benkerroum,
H. Oubel, M. Zahar, S. Dlia, A. Filali-Maltouf // Journal. Applied
Microbiology. - 2002. - №89. - P.960 - 968.
3. Ghalfi,
H. Bacteriocin activity by Lactobacillus curvatus CWBI-B28 to inactivate
Listeria monocytogenes in Cold-Smoked salmon during 4°C storage / H. Ghalfi, A.
Allaoui, J. Destain, N. Benkerroum, P. Thonart // Journal Food Protection. -
2006. - №69. - P. 1066 - 1071.