Биричевская Л.Л., д.б.н. Зинченко А.И.

Институт микробиологии НАН Беларуси

Влияние состава питательной среды и условий культивирования на продуцирование фосфолипазы D культурой Streptomyces netropsis БИМ В-235

Фосфолипаза D (ФЛД) – фермент, осуществляющий специфический гидролиз различных фосфолипидов, а также синтез таких соединений путем реакции трансфосфатидилирования (рис. 1).

+ Н−Х

ФЛД

Рис. 1. Схема реакции трансфосфатидилирования нуклеозидов, катализируемая ФЛД:

R – ацил; Х – остаток нуклеозида; Y – остаток холина.

Особый интерес вызывают ФЛД стрептомицетов, обладающие высокой трансфосфатидилирующей активностью и нетипичной для ферментов широкой субстратной специфичностью. Указанные свойства позволяет использовать ФЛД в качестве инструмента для ферментативной модификации фосфолипидов. В частности, ФЛД микроорганизмов рода Streptomyces способна синтезировать фосфолипиды, имеющие в своем составе природные и модифицированные нуклеозиды. Данный ферментативный способ является достойной альтернативой химическому синтезу этих соединений [1–3]. Нужно отметить, что фосфолипидные производные нуклеозидов рассматривают как основу для перспективных лекарственных препаратов нового поколения [4–8].

Приступив к исследованиям, целью которых является получение эффективного биокатализатора для ферментативного синтеза вышеупомянутых фосфолипидных производных, среди ряда проверенных музейных культур стрептомицетов мы отобрали штамм Streptomyces netropsis БИМ В-235, клетки которого секретируют в культуральную среду ФЛД, способную катализировать перенос фосфатидильных групп с лецитина на 5'-гидроксил нуклеозидов [9]. При этом, удельная активность фермента в составе фильтрата культуральной жидкости (КЖ) оказалась всего в 250 раз меньше таковой препарата высокоочищенного фермента (коммерческого препарата фирмы “Sigma”, США), что свидетельствовало, на наш взгляд, о хороших потенциальных биотехнологических возможностях отобранного штамма.

В настоящей работе нами было изучено влияние некоторых компонентов питательной среды и условий культивирования на образование ФЛД культурой Str. netropsis БИМ В-235. Такие данные необходимы для создания рациональной питательной среды и подбора условий выращивания продуцента, обеспечивающих максимально эффективный биосинтез им ФЛД.

Материалы и методы. В работе использовали штамм Str. netropsis БИМ В-235 (далее по тексту Str. netropsis) из Национальной коллекции непатогенных микроорганизмов Института микробиологии НАН Беларуси.

Культивирование стрептомицета проводили на орбитальной биологической качалке при частоте оборотов 170-190 об/мин и температуре 28–30^оС в течение 1–7 суток в 250 мл колбах Эрленмейера, содержащих 50 мл питательной среды. Посевным материалом служила 18-часовая культура в количестве 10% (об.). В качестве исходной питательной среды (среда I) использовали мясопептонный бульон (МПБ), в который вносили растворимый крахмал до концентрации 1% и соли – NaCl и MgSO₄x7H₂O до концентрации 0,3 и 0,1% соответственно. Величина рН среды составляла 7,2. Указанная среда (с некоторыми модификациями) использовалась Yamaguchi и соавт. [10] для скрининга ФЛД-продуцирующих стрептомицетов.

В процессе подбора оптимальной питательной среды для синтеза ФЛД исследуемым штаммом Str. netropsis использовались также стандартные среды, рекомендованные Международным проектом по стрептомицетам (ISP) для культивирования и изучения характеристик стрептомицетов: овсяная среда (ISP № 3), синтетические – крахмало-аммиачная (ISP № 4), глицерин-аспарагиновая (ISP № 5) [11] и глюкозо-аммиачная (ISP № 9) [12] среды (далее среды II, III, IV и V соответственно). Среды VI, VII и VIII в качестве источника азота вместо (NH₄)₂SO₄ содержали соответственно NaNO₃, NH₄NO₃ и мочевину в концентрации 0,5%. Остальные компоненты те же, что и в составе среды V. На первом этапе исследований в качестве посевного материала для сред I–VIII использовалась суспензия спор и мицелия, получаемая путем смыва их 10-ю мл стерильной среды с поверхности 7-суточной культуры Str. netropsis, выросшей при 28°С в пробирках объемом 50 мл на поверхности скошенного овсяного агара (15 мл). Полученный смыв вносили в питательную среду в количестве 10% (об.).

По окончании культивирования биомассу стрептомицета отделяли фильтрованием через бязь. Выход биомассы определяли весовым методом после высушивания ее до постоянного значения при 105ºС. Фильтрат КЖ использовали в качестве источника ФЛД.

Трансферазную активность ФЛД определяли в реакции переноса фосфатидильного остатка с лецитина на 5'-гидроксильную группу тимидина путем инкубирования при 37^оС в течение 45 мин реакционной смеси (1 мл), состоящей из 67% хлороформа и 33% водной фазы и содержащей 10 мМ тимидин, 30 мМ лецитин, 0,1 М Na-ацетатный буфер (рН 6,0), 0,25 М CaCl₂ и 0,2 мл фильтрата КЖ. За ходом реакции следили, используя тонкослойную хроматографию (ТСХ) на пластинах Silufol-UV₂₅₄ («Serva», Германия) в системе растворителей хлороформ-этанол (4:1). Вещества обнаруживали в УФ-свете и элюировали: нуклеозиды дистиллированной водой, а фосфолипидные производные – этанолом.

Активность ФЛД определяли за время, при котором выход продуктов не превышал 15–20%. За единицу активности фермента принимали такое его количество, которое обеспечивало трансформацию субстрата или образование продукта в количестве 1 нмоль за 1 мин в соответствующих условиях реакции.

Для характеристики продуцирующей способности микробных клеток в отношении ФЛД её активность выражали в ед/мг сухой биомассы, а для характеристики биосинтетической активности культуры в целом (которая зависит не только от продуцирующей способности клеток, но и от выхода биомассы) активность фермента приводили в ед/мл КЖ.

Для описания и анализа процессов роста культуры и биосинтеза фермента удельную скорость роста (m) и удельную скорость синтеза фермента (e) вычисляли по формулам: m = dX×dt^-1×X^-1 и e = dE×dt^-1×X^-1 , где X – биомасса, dX – прирост биомассы, dE – прирост активности фермента за промежуток времени dt [13].

Результаты и их обсуждение. Как известно, уровень биосинтеза ферментов культурами микроорганизмов зависит не только от генетических особенностей штаммов-продуцентов, но, в немалой степени, и от условий (в том числе питательной среды), в которых эти штаммы культивируются.

На первом этапе при подборе питательной среды для оптимального синтеза ФЛД мы сравнили уровень продукции фермента культурой Str. netropsis при выращивании на исходной среде и некоторых средах, рекомендованных ISP для культивирования и изучения характеристик микроорганизмов рода Streptomyces.

На всех исследованных синтетических средах наблюдался слабый рост культуры и отсутствие активности ФЛД в фильтрате КЖ через 7 дней культивирования (табл. 1), тогда как на средах I и II обильный урожай биомассы достигался на 2–3-и сутки выращивания. Однако при этом на овсяной среде, в отличие от среды, использовавшейся для отбора культуры, обнаружились лишь следовые количества ФЛД-активности.

Таблица 1

Накопление активности ФЛД в КЖ в процессе роста культуры Str. netropsis на различных средах

Среда	Биомасса, мг/мл	Активность ФЛД, ед/мл
I	3,3	995
II	3,7	15
III	±*	−**
IV	±	−
V	±	−
VI	±	−
VII	±	−
VIII	±	−

Примечания. * − измерение биомассы не проводилось в связи с незначительным ее количеством. ** − в данных условиях реакции активность не обнаружена.

Представленные данные согласуются с результатами, полученными Yamaguchi и соавт. [10]. В этой работе авторы также отмечают отсутствие продукции ФЛД при выращивании культуры Str. hachijoensis на синтетических средах с минеральными источниками азота, мочевиной, аспарагином.

Таким образом, в качестве исходной среды для оптимизации была выбрана среда I (МПБ c водорастворимым крахмалом), использовавшаяся ранее для отбора штамма-продуцента. Изучение характера роста Str. netropsis на данной среде и образования ФЛД в динамике показало (рис. 2), что накопление биомассы и изучаемого фермента происходит параллельно, начиная с 5 ч, и достигает максимальных значений к 14–15 ч роста культуры. Это указывает на то, что продукция ФЛД связана с экспоненциальной фазой роста культуры.

Анализ кинетических параметров роста Str. netropsis и синтеза ФЛД показал (рис. 3), что максимальная удельная скорость роста наблюдается на 10 ч культивирования и составляет в данных условиях эксперимента 0,25 ч^-1. Максимум удельной скорости синтеза фермента также приходится на 10 ч роста культуры и составляет 75 ед×ч^-1×мг^-1. Это свидетельствует о том, что процессы роста исследуемого штамма и образования им ФЛД совпадают по времени.

Важнейшими составляющими культуральной среды для микроорганизмов являются источники углерода и азота. При изучении взаимосвязи между источниками углерода в среде и биосинтезом ФЛД нами было испытано 6 соединений (табл. 2). При этом, моно-, дисахариды и многоатомные спирты вносили в исходную питательную среду вместо крахмала.

Таблица 2

Влияние источников углерода на накопление биомассы и ФЛД в процессе роста культуры Str. netropsis

Источник углерода, 1%	Биомасса, мг/мл	Активность ФЛД
		ед/мг	%	ед/мл	%
Глицерин	5,7	238	70	1360	66
Глюкоза	6,1	340	100	2070	100
Крахмал*	3,6	285	84	1030	50
Манноза	3,1	300	88	930	45
Сахароза	3,4	295	87	1000	48
Сорбит	3,1	270	80	840	41

Примечание. * − вариант, соответствующий исходной питательной среде.

Установлено, что все источники, кроме глюкозы и глицерина, обеспечивают примерно одинаковый выход биомассы (в пределах 3,1–3,6 мг/мл). Урожай биомассы на средах с глицерином или глюкозой был почти вдвое выше. Что касается биосинтетической активности культуры в отношении ФЛД, вариант среды с глюкозой значительно превзошел все другие, причем не только из-за более высокого выхода биомассы, но и по причине более высокой продуцирующей активности мицелия. Следует отметить, что по данным Yamaguchi и соавт. [10], глюкоза и сахароза являются неподходящими источниками углерода для продукции ФЛД. Однако другие исследователи часто используют глюкозу в составе сред для культивирования штаммов-продуцентов ФЛД [14–18].

Помимо источников углерода, важную роль в синтезе ферментов играют источники азота. В проведенных нами опытах органические источники азота вводили вместо МПБ в исходную среду с 1% глюкозой (вместо крахмала) в качестве источника углерода. Как видно из данных, приведенных в табл. 3, все органические источники азота (в отличие от минеральных) обеспечивали накопление достаточно высокого уровня ФЛД-активности в фильтрате КЖ. Оптимальные результаты получены при использовании дрожжевого экстракта.

Таблица 3

Влияние органических источников азота на накопление биомассы и ФЛД в процессе роста культуры Str. netropsis

Источник азота, 1%	Биомасса, мг/мл	Активность ФЛД
		ед/мг	%	ед/мл	%
Дрожжевой экстракт	7,3	330	100	2410	100
Пептон	6,4	190	58	1220	51
Гидролизат казеина	5,1	225	68	1150	48
Ферментолизат БВК	3,9	320	97	1250	52
МПБ (контроль)	6,2	330	100	2050	85

Примечание. Все среды содержали 1% глюкозы в качестве источника углерода.

Проверка влияния различных концентраций глюкозы на биосинтез ФЛД позволила установить (табл. 4), что максимальное накопление фермента в КЖ происходит при культивировании продуцента на среде с концентрацией глюкозы, равной 0,5–1%.

Таблица 4

Влияние концентрации глюкозы на накопление биомассы и ФЛД в процессе роста культуры Str. netropsis

Концентрация глюкозы, %	Биомасса, мг/мл	Активность ФЛД
		ед/мг	%	ед/мл	%
0	4,5	425	100	1920	82
0,5	5,9	395	93	2340	100
1,0	7,0	335	79	2340	100
2,0	7,0	290	68	2030	87
4,0	7,2	250	58	1785	75

Примечание. Все среды содержали 1% дрожжевой экстракт в качестве источника азота.

Результаты экспериментов по подбору концентрации дрожжевого экстракта в питательной среде отражены в табл. 5.

Таблица 5

Влияние концентрации дрожжевого экстракта на накопление биомассы и ФЛД в процессе роста культуры Str. netropsis

Дрожжевой экстракт, %	Биомасса, мг/мл	Активность ФЛД
		ед/мг	%	ед/мл	%
0,25	2,4	235	46	560	18
0,5	3,6	400	78	1450	48
1,0	5,7	425	83	2420	79
2,0	5,8	510	100	2950	97
4,0	6,5	450	88	3050	100

Примечание. Среда содержала 0,5% глюкозы в качестве источника углерода.

Представленные данные показали, что с увеличением содержания дрожжевого экстракта в среде показатели активности изучаемого фермента растут, однако, с точки зрения экономии субстрата, рационально его вносить в среду в количестве 1–2%.

Еще одним важным фактором, влияющим на рост и метаболизм микроорганизмов при их глубинном культивировании, является концентрация кислорода в среде. Для изучения влияния аэрации на развитие культуры изучаемого актиномицета и ее биосинтетическую активность в отношении ФЛД его выращивали в колбах (250 мл) с различным объемом питательной среды. Из данных, представленных в табл. 6, прежде всего, видно, что увеличение степени аэрации среды способствует накоплению биомассы.

Таблица 6

Влияние аэрации на накопление биомассы и ФЛД в процессе роста культуры Str. netropsis

V/V^*	Биомасса, мг/мл	Активность ФЛД
		ед/мг	%	ед/мл	%
0,1	6,5	435	63	2825	96
0,2**	5,8	510	74	2950	100
0,4	4,3	685	100	2940	99
0,5	3,8	580	85	2210	75
0,6	2,9	535	78	1555	53

Примечание. Питательная среда содержала 0,5% глюкозы и 2% дрожжевого экстракта.

*V/V – отношение объема питательной среды к объему колбы (250 мл).

** – Стандартные условия аэрации.

Что касается продуцирующей активности мицелия, то максимальное ее значение отчетливо выявляется не при максимальной аэрации, а при величине отношения объема питательной среды к объему колбы, равной 0,4. Однако из-за недостаточно высокого выхода биомассы в данном варианте, он не является единственно приемлемым с точки зрения накопления максимального количества фермента в единице объема КЖ. Практически такие же величины активности ФЛД в ед/мл имеют место и в вариантах с более высокой аэрацией среды. Тем не менее, представляется целесообразным использовать в дальнейшей работе соотношение объема среды к объему колбы, равное 0,4, поскольку этот вариант, практически не отличаясь по выходу фермента с единицы объема питательной среды от вариантов с более высокой степенью аэрации, позволяет получать в 2–4 раза более высокий выход фермента с одной колбы.

В дополнительных экспериментах нами было отмечено, что отсутствие солей MgSO₄×7H₂O и NaCl не сказывается на продукции изучаемого фермента культурой стрептомицета при выращивании ее в подобранных условиях культивирования.

Таким образом, в результате проведенных исследований подобрана питательная среда, содержащая (%): глюкозу – 0,5; дрожжевой экстракт – 2,0; (pH 7,2) и степень аэрации среды, обеспечивающие при культивировании Str. netropsis БИМ В-235, накопление около 3 тыс. единиц активности ФЛД в 1 мл КЖ. Оптимизация питательной среды и условий культивирования продуцента позволили в 3 раза увеличить активность фермента в КЖ по сравнению с исходным уровнем. Установлены некоторые закономерности роста культуры стрептомицета и продуцирования ею внеклеточной ФЛД, рассчитаны кинетические характеристики этих процессов.

Литература:

1. Shuto S., Itoh H., Sakai A., Nakagami K., Imamura S., Matsuda A. Nucleosides and nucleotides–CXXXVII. Antitumor phospholipids with 5-fluorouridine as a cytotoxic polar-head: synthesis of 5'-phosphatidyl-5-fluorouridines by phospholipase D-catalyzed transphosphatidylation // Bioorg. Med. Chem.-1995.-Vol. 3, N 3.-P. 235-243.

2. Shuto S., Itoh H., Ueda S., Imamura S., Fukukawa K., Tsujino M., Matsuda A., Ueda T. A facile enzymatic synthesis of 5'-(3-sn-phosphatidyl) nucleosides and their antileukemic activities // Chem. Pharm. Bull. (Tokyo).-1988.-Vol. 36, N 1.-P. 209-217.

3. Hayashi M., Itoh H., Koshio T., Nakagami K., Komiyama K. Antitumor activiti of a novel nucleotide, 5'-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho)-5-fluorouridine (TJ14026) on murine tumors // Biol. Pharm. Bull.-1993.-Vol. 16, N 8.-P. 778-781.

4. Alexander R.L., Kucera G.L. Lipid nucleoside conjugates for the treatment of cancer // Carr. Pharm. Design.-2005.-Vol. 11, N 9.-P. 1079-1089.

5. Morris-Natschke S.L., Ishaq K.S., Kucera L.S. Phospholipid analogs against HIV-1 infection and disease // Curr. Pharm. Des.-2003.-Vol. 18, N 9.-Р. 1441-1451.

6. Mavromoustakos T., Calogeropoulou T., Koufaki M., Kolocouris A., Daliani I., Demetzos C., Meng Z., Makriyannis A., Balzarini J., De Clercq E. Ether phospholipids-AZT conjugates possessing anti-HIV and antitumor cell activity. Synthesis, conformational analysis, and study of their thermal effects on membrane bilayers. // J. Med. Chem.-2001.-Vol. 44, N 11.-Р. 1702–1709.

7. Brachwitz H., Bergmann J., Thomas Y., Wollny T., Langen P. Synthesis and antiproliferative potency of 9-β-D-arabinofuranosyl-2-fluoroadenine phospholopid adducts // Bioorg. Med. Chem.-1999.-Vol. 6, N 7.-Р. 1195–1200.

8. Водовозова Е.Л., Павлова Ю.Б., Полушкина М.А., Ржанинова А.А., Гараев М.М., Молотковский Ю.Г. Новые фосфолипиды – ингибиторы репродукции вируса иммунодефицита человека. Синтез и антивирусная активность // Биоорган. химия.-1996.-Т. 22, № 6.-С. 451-457.

9. Фещенко Л.Л., Барай В.Н., Ерошевская Л.А., Зинченко А.И. Первичный отбор продуцентов микробной фосфолипазы D // Матер. Межд. конф. “Микробиология и биотехнология на рубеже XXI столетия». Мн., 2000. C. 135-136.

10. Yаmaguchi T., Okawa Y., Sakaguchi K., Muto N. Screening and identification of the phospholipase D-producing Streptomyces // Agr. Biol. Chem.-1973.-Vol. 37, N 7.-P. 1667-1672.

11. Shirling E. B., Gottlieb, D. Methods for characterization of Streptomyces species // Int. J. Syst. Bacteriol.-1966.-Vol. 16, Р. 313–340.

12. Atlas R.M. (1993). Handbook of Microbiological Media, Parks L.C. (Ed.), CRS Press, Inc.

13. Terui G. Kinetics of hydrolase production by microorganisms // Pure Appl. Chem.-1973.-Vol. 36, N 3.-P. 377-395.

14. Hatanaka T., Negishi T., Kubota-Akizawa M., Hagishita T. Study on thermostability of phospholipase D from Streptomyces sp. // Biochim. Biophys. Acta.-2002.-Vol. 1598, N 1-2.-P. 156-164.

15. Hagishita T., Nishikawa M., Hatanaka T. Isolation of phospholipase D producing microorganisms with high transphosphatidilatin activiti // Biotechnol. Lett.-2000.-Vol. 22, N 20.-P. 1587-1590.

16. Ogino C., Negi Y., Matsumiya T., Nakaoka K., Kondo A., Kuroda S.,. Tokuyama S., Kikkawa U., Yamane T., Fukuda H. Purification, characterisation, and sequence determination of phospholipase D secreted by Streptoverticillium cinnamoneum // J. Biochem.-1999.-Vol. 125, N 2.-P. 263-269.

17. Carrea G., D’Arrigo P., Secundo F., Servi S. Purification and applications of phospholipase D from a new strain of Streptomyces // Biotechnol. Lett.-1997.-Vol. 19, N 11.-P. 1083-1085.

18. Iwasaki Y., Nakano H., Yamane T. Phospholipase D from Streptomyces antibioticus: cloning, sequencing, expression, and relationship to other phospholipases // Appl. Microbiol. Biotechnol.-1994.-Vol. 42, N 2-3.-P. 290-299.