Химия и химические технологии/ 4. Химико-фармацевтическое производство

к.х.н. Таутова Е.Н., Козаченко Н.Н., Печкурова А.А.

Кокшетауский государственный университет им. Ш. Ш. Уалиханова, Казахстан

Определение основных пигментов шишек Humulus lupulus

Хмель обыкновенный (Humulus lupulus) — многолетнее травянистое двудомное вьющееся растение, с длинным до 10 м и более тонким, полым, четырехгранным стеблем, и острыми крючковатыми шипиками (рис.1). Цветет в начале и середине лета. Произрастает в европейской части России, в Западной Сибири, на Северном Алтае, в Украине, на Кавказе, в Средней Азии. Растет по сырым лесам, кустарникам, лесным болотцам, на богатых почвах. С лечебной целью используются шишки хмеля, заготавливаемые в ясную погоду за несколько дней до полного созревания, когда прицветники еще плотно закрывают шишку.

Соплодия или шишки хмеля содержат горькие вещества, их найдено сейчас около 100 компонентов, главный — лупулин, обладает успокаивающим действием. Шишки содержат также эфирное масло, в составе которого до 230 соединений моно- и сесквитерпенового ряда, в том числе мирцен, кариофиллен, гумулен. Эфирное масло хмеля обладает бактерицидной активностью. В соплодиях хмеля содержатся тритерпеновые и дубильные вещества, липиды, смолы, воск, сахара, триметиламин, камедь, алкалоид хумулин, желтый пигмент, флавоноиды (рутин, астрагалин, изокверцитрин), витамины B₁, B₆, PP, С, оксикоричные кислоты (кофейная, хинная), гумуленовая кислота, изомеры гумулинона; гумулон, лупулин, валерьяновая кислота.

Для медицинских потребностей используют соцветия хмеля обыкновенного, которые по ошибке называют соплодиями — женские «шишки» (Strobuli Humuli lupuli, или Strobuli Lupuli), а также железки хмеля (Glandulae Lupuli), или лупулин (Lupulinum). По своим антисептическим свойствам сильнее салициловой кислоты, что обусловлено влиянием лупулина.

В данной работе было проведено исследование по определению содержания основных пигментов фотосинтетического аппарата, а также методом хроматографии на бумаге осуществили разделение пигментов, содержащихся в шишках хмеля. В качестве объекта исследования использовали шишки хмеля обыкновенного Humulus lupulus, собранные в Акмолинской области (Казахстан).

В первой части работы определили содержание основных пигментов фотосинтетического аппарата в шишках изучаемого объекта – хмеля обыкновенного.

Для извлечения пигментов из растительных тканей и их разделения использовали спирт и ацетон. Так как пигменты быстро выцветают на свету, их экстракцию проводили в затемненном помещении с предварительно охлажденными растворителями. Чтобы предотвратить изомеризацию пигментов, экстракцию следует проводили быстро. Пигменты извлекали последовательно несколькими порциями растворителя, фильтруя каждый раз раствор пигментов через стеклянный фильтр. При растирании шишек добавляли небольшое количество СаСО₃ для нейтрализации кислот клеточного сока и предотвращения феофитинизации пигментов.

В зависимости от природы растворителя, используемого для извлечений пигментов, их концентрации рассчитывали по следующим формулам:

1) в 100%-ном ацетоне:

С_а (мг/л)= 9,784 ·D₆₆₂ - 0,990·D₆₄₄

C_b (мг/л) =21.426 · D₆₄₄-4,650· D₆₆₂

2) в 96%-ном спирте:

С_а(мг/л)=13,70· D₆₆₅-5,76·D₆₄₉

C_b (мг/л) =25,80· D₆₄₉- 7,60·D₆₆₅

Цель первой части работы: определить спектрофотометрически содержание хлорофилла а, хлорофилла в и каротиноидов в исследуемом материале; рассчитать соотношение хл_а/хлв, показать адаптацию пигментного аппарата растений к световому режиму окружающей среды.

Ход работы: Навеску растительного материала (100-200 мг) поместить в маленькую ступку, добавить на кончике скальпеля немного СаСО₃, прилить 4-5 мл спирта и тщательно растереть. Полученную вытяжку слить по палочке на фильтр. Вытяжку перелить в мерную колбу на 25 мл. Полученная спиртовая вытяжка содержит сумму зеленых и желтых пигментов.

Концентрацию хлорофилла а и b определить на ФЭК. Определить оптическую плотность (D) вытяжки при длинах волн, соответствующих максимумам поглощения хлорофилла в спирте и в чистом ацетоне.

Для хлорофилла а в чистом ацетоне максимум поглощения в красной области спектра наблюдается при 662 нм, для хлорофилла b при 644 нм. Каротиноиды определить при 440,5 нм. Концентрации хлорофилла а и b, каротиноидов в суммарной вытяжке рассчитать по формуле Веттштейна:

С_а(мг/л)=13,70· D₆₆₅-5,76· D₆₄₉

C_b (мг/л) =25,80· D₆₄₉- 7,60· D₆₆₅

С_кар=4,695· D_440,5- 0,268(С _а+b)

где С_a, С_b, С_кар – концентрация хлорофилла а, хлорофилла b и каратиноидов в мг/л.

Результаты, проведенных исследований представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1. Оптическая плотность (D) вытяжки.

Образец	Длина волны
	665	440,5	649
Лупулин	0,167	1,125	0,144
Хмель без лупулина	0,131	0,764	0,088
Хмель с лупулином	0,054	0,703	0,030

Таблица 2. Результаты вычислений концентрации пигментов.

Образец	Са	Сb	С(а+b)
Лупулин	1,4815	2,446	5,2
Хмель без лупулина	0,9653	1,2748	3,5839
Хмель с лупулином	0,567	0,3636	3,299

Во второй части работы провели разделение пигментов шишек хмеля методом хроматографии на бумаге. Этот метод основан на разделении пигментов между волокнами целлюлозы хроматографической бумаги и подвижной фазой - растворителем.

Расстояние, пройденное нанесенным на бумагу пигментом в направлении движения растворителя, характеризуется величиной Rf, которая представляет собой отношение расстояния, пройденного растворенным пигментом, к расстоянию, пройденному фронтом растворителя. В стандартных условиях эта величина для данного пигмента постоянна и соответствует его коэффициенту распределения.

Ход работы. Шишки хмеля измельчить, поместить в ступку, добавить немного мела и песка, растереть, постепенно приливая ацетон (на 2-3 г материала примерно 25 мл ацетона). Полученную вытяжку, содержащую сумму зеленых и желтых пигментов, отфильтровать или отцентрифугировать.

Вытяжку налить в стаканчик и погрузить в нее кончик полоски фильтровальной бумаги (4,5 х 15 см). Через несколько секунд, когда вытяжка поднимается по бумаге на расстояние 1-1,5 см. высушить бумагу на воздухе и снова погрузить в раствор пигментов на несколько сек. Эту операцию повторить 5-7 раз до образования у верхней границы распространения пигментов зеленой полосы. Погрузить кончик бумаги на несколько секунд в чистый ацетон, чтобы все пигменты поднялись на 1-1,5 см.

После полного исчезновения запаха ацетона полоску поместить вертикально в хроматографическую камеру, на дно которой налит бензин так, чтобы растворитель не касался окрашенной зоны. Через 15-20 мин растворитель поднимается по бумаге на 10-12 см. При этом пигменты располагаются в следующем порядке: внизу - хлорофилл b желто-зеленого цвета, затем сине-зеленая зона хлорофилла а, затем ксантофилл, выше всех каротин, поднимающийся вместе с фронтом растворителя. Рассчитать значение Rf для каждого пигмента.

Результат проведенного опыта представлен на схеме.

Схема распределения пигментов шишек хмеля методом хроматографии на бумаге.

Таким образом, исходя из полученных данных, можно сделать следующие выводы:

§ в «чистых» шишках хмеля содержится наибольшая концентрация хлорофиллов. При этом в лупулине наблюдается достаточно высокий уровень концентрации как хлорофилла а так и хлорофилла b.

§ значение Rf лежит в пределах от 0.82 до 0.86, следовательно, это доказывает, что как шишки хмеля так и лупулин содержат пигмент β-каротин (в пределах от 0.72 до 0.95).

Литература:

1. Кретович В.Л. Биохимия растений. М.: Высшая школа, 1986.

2. Синяков А.Ф. Лекарственные растения. М.: ЭКСМО, 2010.

3. Всё о 100 самых популярных лекарственных растениях. Атлас справочник. Санкт-Петербург.: СЗКЭО «КРИСТАЛЛ»,2009.

4. Практикум по физиологии растений//Под ред. В.Б. Иванова. М.: Academia, 2001.