Бабаев А.А., Князев Д.И., Новиков Д.В.

Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского

Создание штамма дрожжей Pichia pastoris – продуцента рекомбинантного белка адгезии CD18

Молекулы адгезии, экспрессируясь на поверхности клеточной мембраны, играют важную роль в осуществлении различных иммунологических механизмов. К ним относятся представители суперсемейства интегринов, в частности CD18. Недавно было показано наличие в сыворотке крови человека растворимой формы CD18, которая образуется с участием протеолитических ферментов. При различных патологических состояниях наблюдаются изменения концентрации в сыворотке крови растворимых форм СD18, которые могут выступать в качестве показателей тяжести течения и прогноза заболеваний.

Для исследования структурно-функциональных свойств и для оценки количественного содержания растворимой формы CD18 необходимо получение рекомбинантного аналога данного белка, что и явилось целью работы.

С помощью метода ОТ-ПЦР была синтезирована соответствующая кДНК внеклеточного региона CD18, осуществлено ее клонирование в E. coli в составе челночного плазмидного вектора pPICZα B и произведен отбор трансформантов, содержащих рекомбинантную плазмиду pPICZα B/CD18.

Для детекции рекомбинантной плазмиды использовался метод выделения тотальной нуклеиновой кислоты. В качестве контроля при электрофоретическом разделении использовали линеаризованный вектор pPICZaВ. Определение последовательности внеклеточного региона CD18 проводили методом ПЦР, с использованием в качестве матрицы клеточных лизатов. Использовались праймеры, разработанные для ПЦР-амплификации последовательности СD18. Целостность сайтов узнавания эндонуклеаз рестрикции XhoI и XbaI выявляли при постановке рестрикции с использованием соответствующих ферментов. В качестве контроля при электрофоретическом разделении использовали линейную молекулу вектор и маркер молекулярных масс HindIII/l. В результате проведения скрининга был отобран клон, удовлетворяющий всем требованиям. Электрофореграмма рестрикционного анализа плазмиды, выделенной из клеток этого клона приведена на рисунке 1.

Рис. 1. Рестрикционный анализ плазмиды, выделенной из клеток искомого клона E. coli (размеры и позиции приведены в п.н.о.)

1 – плазмида pPICZaВ; 2 – плазмида pPICZaВ/CD18, обработанная рестриктазами XhoI и XbaI; 3 – маркер молекулярного веса HindIII/l

Далее линеаризованный рекомбинантный вектор pPICZα B/CD18 был трансформирован в клетки дрожжей Pichia pastoris. Встраивание вектора в геном дрожжей сообщает им устойчивость к зеоцину, поэтому первичный отбор трансформантов проводили на твёрдой среде YPD, содержащей антибиотик. В качестве положительного контроля трансформации использовали штамм Х-33, содержащий плазмиду pPICZaВ, не несущую вставки. В результате проведения трансформации клеток P. pastoris штамма X-33 рекомбинантной плазмидой pPICZaВ/CD18 было получено 17 колоний трансформантов.

Проанализировав 17 клонов P. pastoris, установлено, что у двух клонов в хромосомальной ДНК дрожжей выявляется кДНК CD18 (рис. 2). Таким образом, для последующей экспрессии рекомбинантного CD18 было отобрано два штамма дрожжей P. pastoris: X-33/CD18 #6 и X-33/CD18 #7.

Рис. 2. ПЦР-анализ трансформантов P. pastoris (размеры приведены в п.н.о.)

1 – pPICZαB; 2 – ПЦР с ДНК P. pastoris X-33/CD18 #6; 3 - ПЦР с ДНК P. pastoris X-33/CD18 #7.

В результате проведённой работы получены дрожжевые штаммы, содержащие в геноме последовательность внеклеточного региона CD18, и, предположительно, продуцирующие данный белок.