Киян В.С., Сарбасов Д.Д.*, Берсимбаев Р.И.

Евразийский национальный университет им. Л.Н. Гумилева, Казахстан

* Онкологический центр им. М.Д. Андерсон, Техасский университет, США

Изучение взаимодействия рекомбинантных форм белков Importin β1 и mTOR

        

mTOR является высоко консервативной серин-треонин киназой, которая участвует в регуляции уровня питательных веществ внутри клетки и митогенетических сигналах, а также непосредственно изменяет анаболические эффекторные белки. mTOR состоит из двух различных макромолекулярных белковых комплексов. mTOR комплекс 1 (mTORC1) фосфорилирует промежуточные сигналы (р70S6 киназа и eIF4E-связывающий белок 1), участвующие в синтезе белка, росте клеток и клеточной пролиферации. TORC1 содержит адаптерный белок Raptor и мощно подавляется рапамицином [1-3]. mTORC2 содержит адаптерный белок Rictor, устойчив к эффектам рапамицина и контролирует цитокинез и выживание клеток [4]. К стрессовым состояниям клетки, которое снижает деятельность mTORC1, относится голодание питательных веществ, инициирующее катаболические реакции, направленные на переработку энергетических субстратов (аутофагия) или уменьшение энергоемких процессов (оксидативное фосфорилирование и рибосомный биогенез) [5]. У дрожжей регуляция транскрипции генов является важным компонентом клеточного ответа на физической или питательный стресс [6].  Если рассматривать механизм, который требует TOR-связанные фосфотазные субъединицы Tap42 и Pph1, то снижение активности TOR приводит к увеличению в ядре содержания стрессовых транскрипционных факторов Gln3 или MSN2/4. Ядерный импорт Gln3 требует участия кариоферина SRP1 [7]. У млекопитающих гомологами Tap42 и Pph1 являются α4 и PP2Ac, а SRP1 является кариоферином-α1 (KPNA1, импортин-α5). В клетках млекопитающих кариоферины семейства α содержат шесть различных изоформ, каждая из которых действует как адаптер для импортин-β опосредованного ядерного импорта другого подсемейства импортируемых белков [8].

         Цель данной работы изучить взаимодействие рекомбинантных форм белков Importin β1 и mTOR, а также возможное участие mTOR в импорте ядерных белков.

Материалы и методы. Трансфекцию клеточной линии 293Т проводили на 6 см чашках в количестве 2×105 на 1 мл питательной среды путем культивирования в течение 24 часов. Количество трансформированной ДНК составляло 0,5-1,0 мг на 1 чашку. При образовании комплексов ДНК и липофектамина-2000 использовали соотношение 1:3. Культивирование клеток проводили в течение 6 часов, затем вносили стандартную ростовую среду с содержанием 10% фетальной сывороткой плода коровы и антибиотиками. Клетки выращивали в течение 24-48 часов при 37°С и 5% содержанием СО2. Электрофорез проводили в градиентном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия по методу J. Laemmli et al. [9] на аппарате для вертикального электрофореза. Для разделения образцов нами использовались коммерческие градиентные гели 4-12% (фирма «BioRad», США). Перенос белков из электрофорезного геля на нитроцеллюлозную мембрану осуществляли с помощью прибора для иммуноблотинга Owl VEP-2 (фирма «Thermo Scientific», США) по H. Towbin et al. Проявление изучаемых белков на мембране проводили с использованием специфических антител (фирма «Santa Cruz», США). Для лизирования клеток использовали буфер, состоящий из 10 мМ Трис-HCl, pH7.5, 2.5 мМ MgCl2, 1.5 мМ KCl, 0.5% Тритон X-100, 0,2 М LiCl, 0.5% деоксихолата натрия (C24H39NaO4). Перед началом лизирования, в буфер добавляли ингибитор протеаз.

Результаты исследований. Трансфекцию клеток проводили с использованием рекомбинантных белков, у которых имелись специфические метки, позволяющие изолировать комплексы с данными белками: myc-mTOR, flag-Importin β1 и flag-Raptor. Белок flag-Raptor использовали в качестве положительного контроля, так как этот белок входит в состав mTORC1 и позволяет методом иммунопреципитации изолировать изучаемый белок  mTOR. Реакцию иммунопреципитации проводили с использованием специфических антител flag (фирма «Santa Cruz», США). Полученные данные представлены на рисунке 1.

Рисунок 1 – Результаты иммуноблотинга взаимодействия рекомбинантных форм белков Importin β1 и mTOR (Примечание: 1 - myc-mTOR+ flag-Raptor, 2 - myc-mTOR +flag-Importin β1, 3 – flag-Importin β1, 4 – flag-Raptor).

 

         Из рисунка 1 видно, что белок mTOR взаимодействует с белком Raptor, который входит в состав mTORC1 и является консервативным компонентом данного комплекса. Кроме этого, видна четкая связь рекомбинантных форм mTOR и Importin β1, что говорит о возможном участии mTOR в ядерном импорте веществ.

         К основным белкам, участвующим в импорте рибосомальных белков в ядро клетки, относится Importin β1. Так как нами установлена связь данного белка с mTOR, то в дальнейшем была проведена работа по изучению влияния mTOR на ядерный импорт рибосомальных белков. Для этого были использованы условия, влияющие на работу mTOR комплекса: аминокислотное голодание, ингибиторы РР242, Torin, Rapamycin и LY. В эксперименте использовалась клеточная линия MDA-MB-435. Воздействие ингибиторов и аминокислотного голодания проводили в течение 1 часа перед началом лизирования клеток. Анализу подвергались рибосомальные белки RPL5 и RPL26 (рисунок 2).

Рисунок 2 – Результаты использования ингибиторов mTOR

 

         Данные представленные на рисунке 2 показывают, что использование ингибиторов mTOR напрямую влияет на импорт рибосомальных белков, при которых отсутствует связывание Importin β1 с рибосомальными белками RPL5 и RPL26.  Использование стандартных условий без использования ингибиторов показывает значительную связь этих белков.

         Таким образом, проведенные нами исследования указывают на наличие взаимосвязи между двумя белками – mTOR и Importin β1. Установление данной связи позволило показать непосредственное участие mTOR, посредством использования ингибиторов данного белка, в ядерном импорте рибосомальных белков.

Литература:

1. Hara K., Maruki Y., Long X., Yoshino K., Oshiro N., Hidayat S., Tokunaga C., Avruch J. and Yonezawa K. Raptor, a binding partner of target of rapamycin (TOR),  mediates TOR action. // Cell. – 2002. – Vol. 110. – P. 177–189.

2. Kim D. H., Sarbassov D. D., Ali S. M., King J. E., Latek R. R., Erdjument-Bromage H., Tempst P. and Sabatini D. M. mTOR interacts with raptor to form a nutrient-sensitive complex that signals to the cell growth machinery. // Cell. – 2002. – Vol. 110. – P. 163–175.

3. Sarbassov D. D., Ali S. M. and Sabatini D. M. Growing roles for the mTOR pathway. // Cell Biol. – 2005. – Vol. 17. – P. 596–603.

4. Sarbassov D. D., Ali S. M., Kim D. H., Guertin D. A., Latek R. R., Erdjument-Bromage H., Tempst P. and Sabatini, D. M. Rictor, a novel binding partner of mTOR, defines a rapamycin-insensitive and raptor-independent pathway that regulates the cytoskeleton. // Curr. Biol. – 2004. – Vol. 14. – P. 1296–1302.

5. Zoncu R., Efeyan A. and Sabatini D. M. mTOR. From growth signal integration to cancer, diabetes and ageing. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. – 2011. – Vol. 12. – P. 21–35.

6. De Virgilio C. and Loewith R. Cell growth control. Little eukaryotes make big contributions. // Oncogene. – 2006. – Vol. 25. – P. 6392–6415.

7. Carvalho J., Bertram P. G., Wente S. R. and Zheng, X. F. Phosphorylation regulates the interaction between Gln3p and the nuclear import factor Srp1p. // J. Biol. Chem. – 2001. – Vol. 276. – P. 25359–25365.

8. Yasuhara N., Oka M. and Yoneda Y. The role of the nuclear transport system in cell differentiation. // Cell Dev. Biol. – 2009. – Vol. 20. – P. 590–599

         9. Laemmli V.K. Cleavage of structural protection during the assembly of the head of bacteriophage T 4 // Nature. – 1970. – Vol. 27. – P. 680-685.