Гусарова О.В.

Національний технічний університет України „КПІ”

МЕТОДИКА ВИЗНАЧЕННЯ ВТРАТ БІОЛОГІЧНОЇ АКТИВНОСТІ ДЕЯКИХ БІОЛОГІЧНО АКТИВНИХ РЕЧОВИН

Біологічно активні речовини (БАР) - хімічні речовини, необхідні для підтримання життєдіяльності живих організмів, їх фізіологічної активності. За одиницю біологічної активності БАР приймають мінімальну кількість цієї речовини, здатної пригнічувати розвиток чи затримувати ріст певного числа клітин, тканин стандартного штаму (біотесту) в одиниці поживного середовища [1].

Для кожного виду БАР існують свої методи визначення біологічної активності. Так, для ферментів, метод визначення активності Е полягає у реєстрації швидкості зникнення субстрату (S) (речовини, на яку діє фермент) чи швидкості утворення продуктів реакції ([Р]). Активність виражають у міжнародних одиницях (МЕ – це така кількість ферменту, яка при заданих умовах каталізує перетворення 1 мікромолю субстрату за 1 хв.). При проведенні досліджень активність дослідного зразка порівнюють з активністю стандартного зразка при однакових умовах і розраховують активність А в відповідних одиницях МЕ [2].

Для кожного вітаміну існує свій метод визначення активності (кількості вітаміну в дослідному зразку (наприклад, таблетках) в одиницях МЕ). Ці методи складні і вимагають використання високоточного, дорогого та складного обладнання (спектрофотометрів, флуорометрів та ін.), багатьох хімічних реактивів і проведення складних розрахунків [2].

При виготовленні БАР (наприклад, вітамінів, органічних кислот) дуже важливо зберегти задану кількість біологічної активності, яка може втрачатись у процесі нагрівання в результаті підвищення локальних значень температур, утворення нерівномірності потоків розчину, перегріву пристінного шару розчину понад температур термічної стійкості та тривалому часі обробки.

Автори пропонують просту методику визначення втрат біологічної активності для деяких легко доступних видів БАР (лимонної, аскорбінової та оцтової кислот), яку можна провести в лабораторних умовах.

Визначення втрат біологічної активності деяких біологічно активних речовин

Обладнання необхідне для проведення досліджень

Лабораторний стенд призначений для дослідження біологічної активності лимонної, аскорбінової та оцтової кислот складається з електроплитки, колби місткістю 1 л, термопари для вимірювання температур обробки, секундоміра для вимірювання часу, що пройшов з початку експерименту. Для ідентифікації кислот у розчинах використовують штатив, бюретку, мірні стаканчики.

Проведення експериментальних досліджень

1. Приготувати по 900 г розчинів лимонної (С₆Н₈О₇∙1Н₂О), аскорбінової (С₆Н₈О₆) та оцтової кислот (С₂Н₄О₂), з масовою часткою безводневих кислот 5%, використовуючи для розрахунків залежності (1-2) відповідно та (3) [3].

, (1)

де - маса безводневої лимонної кислоти, , г; - концентрація безводневої лимонної кислоти, %; - маса розчину, г; - молярна маса кристалогідрату; - молярна маса безводневої лимонної кислоти.

, (2)

де - маса безводневої аскорбінової кислоти, г; - концентрація безводневої аскорбінової кислоти, %; - молярна маса безводневої аскорбінової кислоти.

Для приготування 5% розчину оцтової кислоти розвести кислоту оцтову "х. ч. льодяну" водою у співвідношенні вказаному у джерелі [2].

, (3)

2. Провести тести на ідентифікацію кислот у розчинах:

2.1. Для лимонної кислоти [4]:

2.1.1. Тест № 1

- розчинити 1 г лимонної кислоти у 100 см³ води,

- додати 2-3 краплі розчину лакмусу до 10 см³ розчину,

- зміна кольору розчину з безкольорового на червоний свідчить про наявність йонів водню (кисле середовище).

2.1.2. Тест № 2

- до 5 см³ розчину лимонної кислоти додати 1 см³ хлориду кальцію, три краплі бромтімолу синього і 1 см³ розчиненої соляної кислоти. Потім додають гідроксид натрію до тих пір, поки колір не зміниться до чисто блакитного, після цього розчин кип’ятять 3 хвилини, охайно перемішуючи протягом періоду нагрівання. Утворення при кип’ятінні білого кристалічного осаду цитрату кальцію, нерозчинного в гідроксиді натрію, але розчинного в оцтовій та соляній кислотах, свідчить про наявність в розчині цитрат-йонів.

При позитивних результатах тестів №1 та №2 лимонна кислота вважається такою, що відповідає стандарту.

2.2. Для аскорбінової кислоти:

Відомо, що біологічна активність залежить від рівня рН розчину. Для перевірки кислотності середовища використовувати лакмусові папірці.

2.3. Для оцтової кислоти [5]:

Для 3-6% розчинів оцтової кислоти рН≈2,4. При проведенні досліджень, для перевірки кислотності розчину, використовувати лакмусові папірці. Візуально перевіряти прозорість розчину та наявність характерного запаху. Також провести якісну реакцію на оцтову кислоту. Для цього 10 мл розчину перенести піпеткою в склянку на 100 мл, додати одну – дві краплі фенолфталеїну і нейтралізувати 10 %-вим розчином соди (до появи стійкого блідо-рожевого забарвлення). Якщо в розчині присутня оцтова кислота, то при додаванні розчину хлориду заліза (III), розчин набуде червоно-бурого забарвлення внаслідок утворення ацетату заліза (III).

3. Помістити 5% розчин однієї з кислот у колбу місткістю 1 л, поставити на електричну плитку, почати нагрів та засікти секундоміром час.

4. Дочекатись початку інтенсивного пароутворення, виміряти за допомогою термопари температуру та за допомогою секундоміра - час. Дані записати у таблицю 1. Відібрати розчини для проведення тестів за п.2.

5. Після того, як розчин закипить, кожні 1-5 хв. заміряти температуру та час, що пройшов з початку експерименту, дані заносити у таблицю 1 та відбирати проби для проведення тестів за п.2.

6. У проміжках між замірами, проводити тести на ідентифікацію відповідної кислоти за п. 2.

7. Дослідження проводити доки всі тести на ідентифікацію для відповідної кислоти не дадуть негативний результат. Це означатиме, що речовина розклалась.

Обробка результатів експериментів

1. Розрахувати втрату активності по залежності (4), [6].

, (4)

де Т – температура обробки розчину, К, τ – час обробки, хв.

2. Отримані дані занести у таблицю 1.

3. Побудувати графічні залежності втрати активності від температури φ=f(Т) та втрати активності від часу ψ= f(τ).

Таблиця 1- результати експериментів

№ п\п	Час τ		Температура Т		Результати тестів за п.2		Втрати активності розчину, %
	с	хв	˚С	К	№1	№2
1	2		3		4		5
1
2
...

Висновки

Дана методика дозволяє досить швидко та просто визначити втрати біологічної активності деяких видів БАР, не потребує дорогого і складного обладнання, досвіду роботи з цим обладнанням та хімічними реактивами. Методика обробки отриманих результатів проста та зручна і дає змогу зручно оцінити втрати біологічної активності у %. Отримані результати можна використовувати при проектуванні обладнання та підбору режимів обробки БАР.

Список літератури

1. Технология синтеза и биосинтеза биологически активных веществ: Учебное пособие / Громова Н. Ю., Косивцов Ю. Ю., Сульман Э. М. – Тверь: ТГТУ, 2006. – 84 с.

2. Государственная фармакопея СССР. XI издание. Выпуск 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье. М, 1990.

3. Степаненко О.М. Загальна та неорганічна хімія. Частина 1 /Степаненко О.М., Рейтер Л.Г., Ледовських В.М., Іванов С.В. - Київ: „Педагогічна преса”, 2002. – 520 с.

4. Кислота лимонна моногідрат харчова. Технічні умови (ГОСТ 908-2004, IDT) ДСТУ ГОСТ 908:2006. Київ : Держспоживчстандарт України. – 2006. – 18 с.

5. Муратова Е.И. Биотехнология органических кислот и белковых препаратов: учебное пособие / Е.И. Муратова, О.В. Зюзина, О.Б. Шуняева. – Тамбов: Изд-во Тамб. гос. техн. ун-та, 2007. – 80 с.

6. Карпов А.М., Саруханов А.В. Теплофизические и физико-химические характеристики продуктов микробиологического синтеза: Справочник / Карпов А.М., Саруханов А.В. – М.: Агропромиздат, 1987. – 224 с.