Акимбеков Н.Ш.

Казахский национальный университет имени аль-Фараби, PhD-докторант

ДЕТОКСИКАЦИЯ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА С ПОМОЩЬЮ КАРБОНИЗОВАННОЙ РИСОВОЙ ШЕЛУХИ В КУЛЬТУРЕ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК КИШЕЧНИКА

Несмотря на многочисленные исследования по поиску путей детоксикации организма от липополисахарида (ЛПС) оптимального решения еще не найдено и потому решение данной проблемы требует разработки новых технологий. Одним из перспективных направлений элиминации ЛПС, являются методы, основанные на их физико-химической адсорбции на различных материалах, в том числе, наноструктурированных на основе карбонизованного растительного сырья.

Эндотоксин липополисахарид (ЛПС) - основной компонент внешней оболочки грамотрицательных бактерий, оказывающий широкий спектр иммуномодулирующего действия. Структурным компонентом, ответственным за токсичность ЛПС, является гидрофобный липид А. Источником ЛПС в организме человека является микрофлора желудочно-кишечного тракта. Многие бактерии теряют компоненты внешней мембраны, заново синтезируя их для поддержания функциональной целостности микробной клетки. Освобождение эндотоксина также происходит при гибели микроорганизмов, и в первую очередь, он действует на эпителиальные клетки.

Цель этого исследования – изучение процессов элиминации эндотоксина в культуре эпителиальных клеток кишечника сорбцией на карбонизированную рисовую шелуху.

Работа проводилась с культурой эпителиальных клеток кишечника, которые в организме человека выполняют важные иммунологические функции, участвуют в синтезе воспалительных и регуляторных цитокинов, которые стимулируют развитие клеток кишечной иммунной системы и поддерживают иммунный гомеостаз в кишечнике при контакте с патогенными бактериями. В случае патологии или расстройствах кишечника ряд функций эпителиальных клеток нарушается. Как известно, ЛПС проявляет огромное воздействие на кишечные эпителиальные клетки (IEC-6), а также их миграцию. Известно, что именно процесс организованной миграции клеток в специфических направлениях к определенным местоположениям необходим для формирования ткани во время заживления ран эпителиальных клеток.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве сорбента для адсорбции ЛПС использовали карбонизованный материал на основе рисовой шелухи. КРШ является одним из самых сложных наноструктурированных частиц, обладающих высокой сорбционной емкостью и объемностью микропор. Химическая структура КРШ довольно сложна. В основном, она состоит из аморфной и микрокристаллической частей.

Карбонизованный сорбент на основе рисовой шелухи (КРШ), полученный в Институте проблем горения при КазНУ им. аль-Фараби (Алматы), был любезно предоставлен проф. З.А.Мансуровым. Исследования по изучению процессов элиминации ЛПС проводились в лаборатории клеточной биофизики и микробиологии Ахенского Университета Прикладных Наук (Германия).

Для эксперимента в условиях in vitro использовали культуру эпителиальных клеток кишечника IEC-6 мышей. Клетки, согласно протоколу, выращивали в специальных чашках (Nunc Multidishes Nunclon, 152640) между пассажами 5-13, добавляя соответствующий объем среды PromoCell (80-90% MEM + 10-20% FBS + 2 mM L-glutamine + non-essential amino acids). Затем культуры IEC-6 обрабатывали различными дозами КРШ: 0,005, 0,01 и 0,05 мг/мл и помещали в инкубатор (37°C, 5% CO₂) на 24 часа. В качестве контроля брали рост культур без добавления КРШ. Для очистки клеток от КРШ культуры через 24 часа смывали фосфатно-буферным физиологическим раствором и окрашивали красителем Diff Quick. После окрашивания клетки фотографировали под оптическим микроскопом (Axovert 100M, Германия). Количество клеток подсчитывали в 12 различных участках культуры.

Для изучения процесса миграции эпителиальных клеток культуры IEC-6 расцарапывали по длине с помощью клеточного скальпеля, и добавляли ЛПС в количестве 2мкг/мл на следующие варианты клеточных культур: IEC-6; IEC-6 с КРШ (в концентрации 5 мг/мл) и IEC-6 с КРШ и без ЛПС; IEC-6 КРШ и без ЛПС. Цифровые изображения были получены в культурах в t = 0 и 12 ч. Эксперимент проводили трижды.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Определение эффекта КРШ на рост IEC-6 проводили с помощью подсчета жизнеспособных клеток в культурах. Сравнение роста культур при различных концентрациях КРШ показало (рисунок 1), что применение КРШ в концентрации 0,01 и 0,05 мг/мл незначительно влияет на рост культур, тогда как, использование КРШ в концентрации 0,005мг/мл привело к увеличению роста клеток. Согласно полученным результатам, количество жизнеспособных клеток уменьшается пропорционально увеличению концентрации КРШ.

Для изучения сорбции ЛПС на КРШ в культуре IEC-6 и миграцию клеток в культуре добавляли различные концентрации КРШ на 24 ч, затем с помощью расцарапывания культуры образовывали линейную рану по поверхности культуры. Процесс заживления модельной раны наблюдали в течение 48 ч. Поскольку заживление раны зависит от скорости миграции, в работе была изучена миграция клеток испытуемой культуры.

Рис. 1. Жизнеспособность IEC-6 при различных концентрациях КРШ

На рисунке 2 показаны результаты изучения миграции клеток в различных образцах культуры. В контрольных образцах, миграция клеток, т.е. заживление модельной раны, произошло за 12 ч. Аналогичные результаты были получены в клеточных культурах с КРШ (5 мг/мл) и ЛПС (2 мг/мл); с КРШ (5 мг/мл).

В клеточных культурах с ЛПС наблюдалась значительная задержка процесса миграции IEC-6, что соответствует литературным данным [1,2], в которых описывается отрицательное воздействие ЛПС на миграцию клеток. На жизнеспособность клеток ЛПС в течение 12 ч не оказывал никакого влияния.

Рис. 2. Миграция IEC-6: а - контроль (без ЛПС); b - IEC-6 с ЛПС; с - IEC-6 с ЛПС и КРШ; d-IEC-6 с КРШ)

Для того, чтобы клетки были способны мигрировать свободно, они должны быть расслабленными. Присутствие ЛПС в среде ведет к формированию напряженных волокон (stress fibers)и, вследствие этого, клетки становятся прикрепляемыми. После обработки ЛПС обнаруживается увеличение плотности напряженных волокон в клетках, так в IEC-6 культурах с ЛП С волокон, которые могут снизить их способность к мигрированию больше, чем в контроле. В культурах без ЛПС волокна не формируются, клетки остаются в состоянии мигрирования и покрывают всю поверхность матрикса.

Таким образом, в экспериментах in vitro выявлено влияние ЛПС на миграцию IEC-6 и показано, что ЛПС замедляет (тормозит) движение IEC-6, тогда как при добавлении различных концентраций карбонизированной рисовой шелухи (КРШ) миграция клеток продолжается. Следует отметить, что сорбционная активность КРШ в отношении препарата ЛПС очень эффективна, вследствие чего после обработки КРШ наблюдается миграция клеток в культуре, свидетельствующая об активной элиминации ЛПС с клеточной поверхности. Это означает, что КРШ является перспективным материалом для детоксикации ЛПС [3,4,5].

Полученные результаты могут быть использованы для разработки новых эффективных методов для детоксикации ЛПС, вызывающего расстройства желудочно-кишечного тракта, иммунные нарушения и т.п. в организме человека.

ЛИТЕРАТРА

1. Selma Cetin, Henri R. Ford, Laura R. Sysko., Endotoxin inhibits intestinal epithelial restitution through activation of Rho-GTPase and increased focal adhesions. //The journal of biological chemistry. 24592–24600, 2004.

2. Baughman, R. H.; Zakhidov, A. A.; de Heer, W. A., Carbon nanotubes--the route toward applications. //Science. 297 (5582): 787-92, 2002.

3. Hu, H.; Ni, Y.; Mandal, S. K.; Montana, V.; Zhao, B.; Haddon, R. C.; Parpura, V., Polyethyleneimine

functionalized single-walled carbon nanotubes as a substrate for neuronal growth. //J. Phys. Chem. B. 109 (10):4285-9, 2005.

4. Kostarelos, K.; Lacerda, L.; Pastorin, G.; Wu, W.; Wieckowski, S.; Luangsivilay, J.; Godefroy, S.; Pantarotto, D.; Briand, J. P.; Muller, S.; Prato, M.; Bianco, A., Cellular uptake of functionalized carbon nanotubes is independent of functional group and cell type. //Nat. Nanotechnol. 2 (2): 108-13, 2007.

5. Kaiser, J. P.; Wick, P.; Manser, P.; Spohn, P.; Bruinink, A., Single walled carbon nanotubes (SWCNT) affect cell physiology and cell architecture. //J. Mater. Sci. Mater. Med. 19 (4): 1523-7, 2008.