Биологические науки/10. Генетика и цитология

Лукина Н.А., Трухина А.В., Ваккеров-Коузова Н.Д., Рубцова Е.Р., Некрасова А.А., Смирнов А.Ф.

Санкт-Петербургский государственный университет, Россия

Исследование влияния летрозола и тамоксифена на дифференцировку гонад у кур

Согласно современным представлениям, дифференцировка пола позвоночных представляет собой многоступенчатый процесс, который контролируется многими генами [1]. Так предполагают, что у птиц гены Dmrt1, Sox9, гемогена (cHEMGN) участвуют в образовании гонады самцов [2, 3], а гены Foxl2, Wnt4, Rspo1 – в детерминации гонады самок [4]. Экспрессия этих генов подавляется или активируется определенными факторами, действующими в определенные периоды развития организма [1, 5, 6].

В отличие от плацентарных, у которых пол эмбриона в значительной степени определяется генотипом, у рыб, амфибий, рептилий, птиц и даже сумчатых для фенотипической дифференцировки гонад изначально необходимо присутствие гормонов [7, 8]. В частности, для появления яичников необходимо присутствие достаточного количества эстрогенов [9]. Так, ранее было показано, что эстроген необходим для развития яичников у птиц. Он контролирует пролиферацию клеток кортекса левого яичника и выявляется в гонадах куриного эмбриона на ранних стадиях развития. Эстрогены у млекопитающих в большей степени влияют на дифференциацию, а не детерминацию, гонад. Это, возможно, потому, что млекопитающие являются живородящими, и эстрогены могут оказывать существенное влияние на дифференцировку семенников у плода [10].

Немаловажное значение в передаче сигнала от эстрогена играет его собственный рецептор. Ген рецептора эстрогена альфа (ERα) экспрессируется в кортексе гонады у обоих полов кур до половой дифференциации. Позднее его экспрессия супрессируется в гонадах самцов и правой дегенерирующей гонаде самок. Предполагается, что у млекопитающих комплекс ER–Е (эстрогеновый рецептор – эстроген) блокирует поступление в ядро белка SOX9, или попадая в ядро вместе с FOXL2, супрессирует транскрипцию SOX9 непосредственно связываясь с его энхансером TESCO. Таким образом, расхождения в детерминации пола гонад у млекопитающих и иных групп позвоночных можно объяснить межвидовыми различиями в возникновении комплекса ER–E [10].

Для изучения роли гормонов в детерминации и дифференцировке половых структур традиционно используют синтетические эстрогены (диэтилстилбистрол, этинилэстрадиол), антиэстрогены (тамоксифен) и ингибиторы ароматазы (фадразол и др.). Одним из экспериментальных подходов является индукция инверсии пола с помощью этих веществ. Так проведены эксперименты с использованием ингибитора ароматазы фадрозола, эстрогенов и их синтетических аналогов, в которых наблюдалось превращение генетических самок в фенотипических самцов или, наоборот, самцов – в самок [3, 11-13]. В опытах на эмбрионах курицы показано, что при введении экзогенных эстрогенов на ранних стадиях эмбриогенеза у генетических самцов (ZZ) наблюдается феминизация гонад; в то же время при использовании ингибитора ароматазы (фадразол) происходит маскулинизация гонад генетических самок (ZW) [14]. Ингибирование ароматазы так же вызывает инверсию пола, т.е. формирование у генетических самок мужских гонад. Вместе с тем, в ряде работ показана роль веществ (таких как тамоксифен), блокирующих рецепторы эстрогенов, которые синтезируются в медуллярной области гонад обоих полов. В норме экспрессия генов рецепторов эстрогена блокируется в гонадах самцов и в правой редуцирующейся гонаде самок. Вещества, модулирующие рецепторы эстрогенов, также оказывают маскулинизирующий эффект на гонады генетических самок [15-18].

Для получения дополнительной информации о роли веществ, влияющих на дифференцировку пола у птиц, мы использовали ингибитор ароматазы летрозол (Letrozole, Novartis Pharma, Швейцария), а также модулятор рецепторов эстрогена тамоксифен (Австрия) в разных дозах и сочетаниях, вводя их в инкубируемые яйца кур.

Материал и методы

В опытах использовали оплодотворенные яйца курицы породы Хайсекс белый, которые инкубировали при 37,8^оС и влажности 55 – 60%. Количество яиц, исследованных в шести сериях опытов, составило 140 штук (по 20 штук на эксперимент + 20 штук контроль). Для определения наибольшего эффекта на гонады эмбрионов были проведены опыты с использованием ингибитора ароматазы летрозола и модулятора рецепторов эстрогена тамоксифена, растворенные в 1xPBS (1.7mM KH₂PO₄, 5.2mM Na₂HPO₄x7H₂O, 150mM NaCl). Вещества вводили в яйца либо только на 5-е сутки, либо на 5-е и 12-е сутки инкубации. Во всех экспериментах вещество вводили через отверстие в воздушной камере на подскорлуповую оболочку, контактирующую с кровеносными сосудами эмбриона. В качестве контроля в яйца вводили по 0.1 мл буфера 1xPBS на 5-е и 12-е сутки развития. Серии проведенных опытов отражены в таблице 1.

Гонады 19-суточных эмбрионов были зафиксированы в фиксаторе Кларка (смесь этилового спирта и уксусной кислоты (3:1)) и после обычной гистологической обработки были приготовлены препараты парафиновых срезов гонад. Для анализа срезов с помощью микроскопа препараты были окрашены гематоксилином по Майеру [19].

Генетический пол эмбрионов определяли методом Touchdown-ПЦР с использованием праймеров для гена CHD1 курицы: CHD1F: GTTACTGATTCGTCTACGAGA и CHD1R: ATTGAAATGATCCAGTGCTTG. Условия ПЦР были стандартными. Сначала производили денатурацию при 94^оС в течение 5 минут, затем постепенное понижение температуры с 60^оС до 50^оС по одной минуте в каждом случае и далее 35 циклов: 30 секунд при 94^оС, 30 секунд при 50^оС, 1 минуту при 72^оС. Последний этап ПЦР реакции проводили 10 минут при 72^оС. Анализ ПЦР-продукта осуществляли в агарозном геле. У самца наблюдали один амплификат, у самки – два продукта реакции [20].

Таблица 1. Серии опытов, проведенных на эмбрионах курицы.

№ опыта	Действующее вещество	число инъекций	Доза/яйцо	Сутки инкубации
1	летрозол	1	100мкг	5-е
2	тамоксифен	1	100мкг
3	тамоксифен	1	200мкг
4	летрозол	2	по 100мкг	5-е и 12-е
5	тамоксифен	2	по 100мкг
6	тамоксифен +летрозол	2	по 100мкг	тамоксифен: на 5-е сутки летрозол: на 12-е сутки

Результаты

Эффект влияния использованных агентов (летрозола и тамоксифена) на развитие гонад курицы оценивался на основании анатомических (парные или непарные гонады, их размеры и форма) и морфологических критериев (наличие или отсутствие семенных канальцев, состояние половых клеток). У контрольных 19-ти суточных эмбрионов самок присутствовала типичная левая гонада, состоящая из медуллы и кортекса. В ней выявлялись многочисленные половые клетки, преимущественно на стадиях профазы мейоза. У контрольных самцов того же возраста семенники были парными, меньшего размера, а в семенных канальцах присутствовали в основном сперматогонии. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 2. Как следует из таблицы, во всех вариантах опытов у генетических самок наблюдались отклонения от нормы в строении гонад. В случае опытов с летрозолом в гонадах самок были выявлены изменения в толщине кортекса (он стал тоньше), а также появление в медулле семенных канальцев. Изменилось и количество половых клеток на стадии профазы мейоза. Их стало больше. В случае опытов с тамоксифеном при однократной инъекции изменения в гонадах эмбрионов самок и самцов практически не выявляются. Однако при двойной инъекции тамоксифена или при двойной его дозе уже наблюдаются изменения: у самцов одна из гонад гипертрофируется, а у самок в основном сохраняются обе гонады. Как правило, у таких самок в гонадах можно выявить и семенные канальцы. Количество половых клеток на стадии профазы мейоза также стало больше.

Таблица 2. Особенности морфологии и микроструктуры гонад у экспериментальных самцов и самок.

№ опыта	Действующее вещество (число инъекций/доза, мкг)	Общее число эмбрионов	Генетические самцы					Генетические самки
			Число самцов	Морфология гонад		Микроструктура гонад		число самок	Морфология гонад		Микроструктура гонад
				нормальные семенники.	асимметричные семенники	Атипичная микроструктура гонад	Наличие профаз мейоза		с нормальной левой гонадой	с двумя гонадами	Наличие семенных канальцев	Атипичные семенные канальцы	«фолликулы»	Наличие профаз мейоза
1	Летрозол (1/100)	10	4	4	0	0	0	6	0	6	6	0	0	6
2	Тамоксифен (1/100)	15	8	8	0	0	0	7	5	2	2	0	5	7
3	Тамоксифен (1/200)	13	6	4	2	0	0	7	1	6	3	3	1	7
4	Летрозол (2/100)	12	9	9	0	0	0	3	0	3	2	1	0	3
5	Тамоксифен (2/100)	10	5	5	0	0	0	5	4	1	2	0	3	5
6	Тамоксифен (1/100) + Летрозол (1/100)	11	7	7	0	0	0	4	1	3	1	0	3	4

Обсуждение

Исходя из полученных нами данных наибольший маскулинизирующий эффект на гонады самок наблюдался после двукратного введения летрозола на 5-е и 12-е сутки развития эмбрионов (опыт №4). У всех генетических самок были обнаружены парные гонады, причем левая представляла собой овотестис, а правая имела сходство с семенником. Такой же эффект был выявлен другими исследователями при введении фадразола [21] и воразола [22]. Однократные и двукратные инъекции тамоксифена не вызвали существенного маскулинизирующего влияния на гонады генетических самок, что можно объяснить, вероятно, недостаточной дозой вещества (опыт № 2, 5). Использование двойной дозы тамоксифена для однократной инъекции привело к развитию гонад самок по типу самца (опыт №3).

Согласно общепринятым представлениям о детерминации пола у кур на третий день эмбрионального развития гонада еще бипотенциальна и морфологически семенник начинает проявляться на шестые сутки инкубации, что совпадает по времени с началом экспрессии генов Dmrt1 и Sox9. В последующем формируются парные семенники и семявыносящие протоки. Их дифференцировка завершается к девятому дню эмбриогенеза. При развитии яичников репрессированный у самцов ген Foxl2 начинает экспрессироваться на пятые сутки эмбрионального развития и активирует ген ароматазы. Параллельно и последовательно активируются гены RSPO1/Wnt4. При этом происходит фрагментация медуллы яичника, формирование лакун, пролиферация клеток кортекса в левой гонаде на фоне регрессии правой гонады, что приводит к асимметрии этого органа [4].

Хорошо известно, что ароматаза участвует в синтезе эстрогенов из тестостерона, исходно считавшегося мужским гормоном. Поэтому использование ингибиторов ароматазы приводит к подавлению образования эстрогенов. Тестостерона становится больше, эстрогенов — меньше, и изначально бипотенциальная гонада развивается по мужскому типу не зависимо от генотипа. Такая интерпретация детерминации пола у кур полностью подтверждается в наших экспериментах с летрозолом и, в принципе, совпадает с результатами других работ, в которых использовались иные ингибиторы ароматазы [3, 12, 13]. Согласно нашим данным одна или две последовательные инъекции на 5-е и 12-е сутки дают сходные результаты. Таким образом, у генетических самок развивается левая гонада в виде овотестиса и правая гонада — в виде семенника.

Следует отметить также, что в овотестисах маскулинизированных самок половые клетки и в кортексе и в медуле гонад находятся на стадиях зиготены – пахитены профазы мейоза, как и ооциты в яичниках контрольных самок на тех же стадиях развития эмбрионов. В норме у самцов вступление первичных половых клеток (ППК) в мейоз наблюдается только после вылупления, а до вылупления присутствуют лишь сперматогонии. У нормальных же самок переход ППК в мейоз начинается в левом яичнике на 8 день инкубации [23]. Причиной наличия ППК в профазе мейоза у маскулинизироаных самок может быть их нечувствительность к воздействию летрозола и тамоксифена. Ранее было показано, что вхождение ППК самцов в мейоз можно индуцировать с помощью инъекции ретиноидной кислоты [24]. Сопоставляя эти данные, можно предположить, что ингибирование ароматазы не влияет на действие ретиноидной кислоты у самок. Поэтому дифференцировка яичника и вступление половых клеток в профазу мейоза — это два независимых процесса. Вопрос о судьбе половых клеток гонад у самок после инверсии пола летрозолом и тамоксифеном необходимо дополнительно исследовать.

Тамоксифен является модулятором рецептора эстрогена и конкурирует с эстрогеном за формирование комплекса с одним и тем же рецептором. В результате эстроген не может проникнуть в клетки развивающейся женской гонады или проникает в них в очень малом количестве. Это приводит к маскулинизации гонады. Действительно, при однократной (опыт №3) и двукратной инъекции (опыт №5) тамоксифена в яйцо наблюдался подобный эффект, но в значительно меньшей степени, чем при использовании летрозола. Маскулинизирующий эффект тамоксифена отмечен и в ряде других работ [25; 26]. Вероятно, это связано с механизмами действия этих двух веществ: летрозол более прочно ингибирует ароматазу, чем тамоксифен блокирует рецепторы эстрогенов. Конкуренция за рецепторы не способствует более активному выключению действия эстрогенов на дифференцировку пола у птиц. За этот факт говорят и результаты опыта №6. Исходя из полученных результатов и основываясь на все опыты с использованием ингибитора ароматазы и модулятора рецепторов эстрогена, можно предположить, что ключевым игроком в дифференцировке женских гонад у птиц является именно ароматаза. От ее активности зависит дальнейшая судьба индифферентной гонады. С другой стороны, на пол эмбриона влияет и активность гена рецептора эстрогенов. Если она окажется на низком уровне, то при достаточном количестве эстрогенов, возможно, также следует ожидать маскулинизацию гонад самки у птиц.

У млекопитающих синтез стероидов начинается после формирования гонад. Так, у мышей яичники образуются даже при отсутствии рецептора эстрогена. В то же время у птиц синтез стероидов начинается в еще недифференцированных гонадах. Принципиальные различия в детерминации пола у этих групп позвоночных следует искать, учитывая эти особенности.

Заслуживают пристального внимания экспериментальные подходы к изучению инверсии пола у птиц в качестве инструмента для описания особенностей генетики пола позвоночных. Полученные результаты позволят в последующих экспериментах идентифицировать новые гены, которые вовлечены в процесс детерминации и дифференцировки пола у птиц.

Литература:

1. Кожухарь В.Г. SRY и SOX9 – главные факторы генетической детерминации пола у млекопитающих // Цитология, 2012.—Т.54(5). —С. 390-404.

2. Smith C.A., Roeszler K.N., Ohnesorg T., Cummins D.M., Farlie P.G., Doran T.J., Sinclair A.H. The avian Z-linked gene DMRT1 is required for male sex determination in the chicken // Nature, 2009. — 461 (7261). — p.267-71.

3. Nakata T., Ishiguro M., Aduma N., Izumi H., Kuroiwa A. Chicken hemogen homolog is involved in the chicken-specific sex-determining mechanism // PNAS, 2013. — 110 (9) — p. 3417-3422.

4. Ayers K.L., Sinclair A.H., Smith C.A. The molecular genetics of ovarian differentiation in the avian model // Sexual Development, 2013. — 7 (1-3) — p.80-94.

5. Gamble T., Zarkower D. Sex determination // Curr Biol, 2012. — 22 (8) — R257-262.

6. Eggers S., Sinclair A. Mammalian sex determination—insights from humans and mice // Chromosome Res., 2012. — 20(1) — p.215-238

7. Nakamura M. Sex determination in amphibians // Seminars in Cell & Developmental Biology, 2009. —20(3) — p. 271-282

8. . Smith C.A. Sex determination in birds: a review //Emu, 2010. — 110 — p. 364-377.

9. Ditewig A.C., Yao H.H. Organogenesis of the ovary: a comparative review on vertebrate ovary formation // Organogenesis, 2005. — 2(2) — p.36-41

10. Pask A.J. A role for estrogen in somatic cell fate of the mammalian gonad // Chromosome Res, 2012. — 20(1) — p.239–245.

11. Elbrecht A., Smith R.G. Aromatase enzyme activity and sex determination in chicken // Science, 1992. — 255 (5043) — p.467-470.

12. Vaillant S, Magre S, Dorizzi M, Pieau C, Richard-Mercier N. Expression of AMH, SF1, and SOX9 in gonads of genetic female chickens during sex reversal induced by an aromatase inhibitor // Developmental Dynamics, 2001. — 222(2) — p.228-237

13. Li-xiu F., Rui X., Yi C., Shi-qing X. Expression of sex-related genes in chicken embryos during male-to-female sex reversal exposure to diethylstilbestrol // J. Integrative Agriculture, 2013. — 12(1) — p.127-135

14. Abinawanto, Shimada K., Yoshida K., Saito N. Effects of aromatase inhibitor on sex differentiation and levels of P450_17α and P450_arom messenger ribonucleic acid of gonads in chicken embryos // Gen. Comp. Endocrinol., 1996. —102 — p.241–246

15. Gill-Sharma M.K, Balasinor N, Parte P, Aleem M, Juneja H.S. Effects of tamoxifen metabolites on fertility of male rat // Contraception, 2001. —63(2) — p.103-109.

16. Halldin K.. Impact of endocrine disrupting chemicals on reproduction in Japanese quail // Domestic Animal Endocrinology, 2005. — 29(2) — p.420-429.

17. Brunstrom B., Axelsson J., Halldin K. Effects of endocrine modulators on sex differentiation in birds // Ecotoxicologia, 2003. — 12 — p.287-295.

18. Lisowski M., Bednarczyk M. Effects of tamoxifen dose and nutrition scheme during growth on stimulation of the reproductive system in cornish breed cocks // Folia biologica (Kraków), 2005. — 53(1-2) — p.1-6.

19. Барыкина Р.П., Веселова Т.Д., Девятов А.Г., Джалилова Х.Х., Ильина Г.М., Чубатова Н.В. Справочник по ботанической микротехнике. Основы и методы. М.: Изд-во МГУ, 2004.

20. Griffiths R., Double M.C., Orr K., Dawson R.J.G. A DNA test to sex most birds // Mol.Ecol., 1998. — 7 — p.1071-1075.

21. Yang X, Zheng J, Na R, Li J, Xu G, Qu L, Yang N. Degree of sex differentiation of genetic female chicken treated with different doses of an aromatase inhibitor // Sex Development, 2008. — 2(6) — p.309-315

22. Dewil E., Buyse J., Veldhuis J. D., Mast J., DeCoster R., Ducuypere E. In ovo treatment with an aromatase inhibitor masculinizes postnatal hormone levels, abdominal fat pad content, and GH pulsatility in broiler chickens // Dom. Anim. Endocrinol, 1998. — 15. — p.115–127.

23. Nakamura Y. Kagami H., Tagami T. Development, differentiation and manipulation of chickengerm cells // Develop. Growth Differ, 2013. —55 —p.20–40.

24. Некрасова А.В., Лукина Н.А., Козикова Л.В., Смирнов А.Ф. Влияние ретиноидной кислоты на мейоз у куриного эмбриона (Gallus domesticus). // Цитология.. — 2011 — 53(8) — С. 659-664.

25. Scheib D., Mignot Th. M., Guichard A. Effects of early tamoxifen treatment on hormonal content of 15-day quail embryo gonads // General and Comparative Endocrinology, 1984. — 56 — p.425-432

26. Hutson J. M., Donahoe P. K., MacLaughlin, D. T. Steroid modulation of Mullerian duct regression in the chick embryo // Gen. Comp. Endocrinol., 1985. — 57 — p.88–102.