УДК 543.544.574.577

К.х.н. Бекташи Н.Р.

Научноисследовательский проектный институт нефти и газа

ВЭЖХ ПОЛИСАХАРИДОВ И ПОЛИАЦЕТИЛЕНОВ, ПОЛУЧЕННЫХ В ПРОЦЕССЕ БИОСИНТЕЗА БАЗИДИАЛЬНЫМИ ГРИБАМИ

Методами двухдетекторной ВЭЖХ, именно, эксклюзионной и обращенно-фазовой адсорбционной жидкостной хроматографии осуществлен контроль за процессом биосинтеза полисахаридов и полиацетиленовых соединений базидиальными грибами рода Ganoderma lucidum и Pleurotus ostreatus распространенных в лесах различных экологических территориях Азербайджана. При выращивании указанных грибов в условиях глубинного культивирования в составе их мицелий выделены и идентифицированы 4 фракции полисахаридов с разными параметрами ММР и 5 фракций полиацетиленовых соединений, сопряженными ненасыщенными связями с различной функциональностью. Выявлены факторы регулирующие их соотношений.

Ключевые слова: Базидиомицеты, эксклюзионная хроматография, обращенно-фазовая адсорбционная жидкостная хроматография, полисахариды, полиацетилены.

ВВЕДЕНИЕ

Известно, что базидиомицеты являются источниками целого ряда биологически активных веществ белков, липидов, полисахаридов, органических кислот, ферментов, витаминов, полиацетиленов и др. многие из которых являются биологически активными продуктами и по сравнению с продуктами химического синтеза менее токсичны и более эффективны [1]. Среди них наиболее выраженным обладают полисахариды (ПС) и полиацетилены (ПА), последние которые содержат в себе много реакционноспособных сопряженных тройных и двойных связей. Использование баздиомицетов в качестве источников ПА соединений и ПС очень перспективны, т.к. открывают их дальнейшее применение для получения биологически активных препаратов, которые могут быть использованы в медицине [2-4]. В настоящее время наиболее мощнейшими методами разделения и идентификации, перечисленных соединений, являются методы высокоэффективной жидкостной хроматографии, именно, эксклюзионной, адсорбционной, ионообменной, тонкослойной хроматографии, и т.д. [5]. В настоящей работе комплексным использованием двухдетекторной эксклюзионной и обращенно-фазовой адсорбционной жидкостной хроматографии (ЭЖХ, ОФАЖХ) исследованы молекулярно-массовое распределение и функциональные составы ПС и ПА, источниками получения которых являлись базидиомицеты рода Ganoderma lucidum и Pleurotus ostreatus.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Грибы выращивались методом глубинного культивирования в среде, состоящей из пщеничного отрубля на среде Чапека–Докса следующего состава (гр/л): NaNO₃ -2, K₂HPO₄ -1, MgSO₄·7H₂O - 0.5, KCl-0.5, FeSO₄·H₂O-0.01, глюкоза-30 и H₂O. Культивирование проводилось в термостате при 28⁰С в течение 10 дней. Далее образующуюся биомассу грибов измельчали и экстрагировали этиловым эфиром уксусной кислоты и водой. Об обработке биомасс подробно описаны в работах [6] и [7]. Полученные осадки и эфирные экстракты подверглись анализу. Хроматографические исследования проведены на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы «Kovo» (Чехия). Были применены двух детекторные варианты

эксклюзионной и обращенно-фазовой адсорбционной жидкостной хроматографии (ЭЖХ, ОФАЖХ). Детекторы: рефрактометр и УФ-спектрофотометр (254нм). Использованы колонки с размером 3,3×150 мм, заполненные сорбентами марки «Separon-SGX» (ЭЖХ) пористостью 100 Å, и «Separon-SGX C-18» обращенной фазой (ОФАЖХ), размерами частиц 7мкм. Элюенты диметилформамид и ацетонитрил+Н₂О(75+25 об.%) последовательно, скорость подачи 0,3 мл/мин. Т=20-25^О . Параметры молекулярно-массового распределения (ММР) определяли методом ЭЖХ [8]. При этом калибровочную зависимость lgM от объема удерживания V_R в эксклюзионном режиме в диапазоне М=(1.5-50)×10² получили с использованием низкомолекулярных полисахаридов. Она описывается уравнением V_R= C₁- C₂ lgM , С₁=24.4, С₂= 4.0

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Продукты биосинтеза были исследованы методами обращенно-фазовой адсорбционной и эксклюзионной жидкостной хроматографии (ОФАЖХ и ЭЖХ). Были использованы двухдетекторные варианты указанных методов (рефрактометр, УФ-спектрофотометр), позволяющие параллельно оценить ММ и функциональные характеристики синтезированных продуктов. Результаты ЭЖХ и ОФАЖХ исследований водных и эфирных экстрактов полученных после обработки культуральной жидкости соответствующих базидиальных грибов (Ganoderma lucidum, Pleurotus ostreatus) представлены в таблице и на рис.1. Установлено, что между результатами полученныx в случае указанных видов базидиальных грибов существует большое сходство. В обоих случаях по характеру ОФАЖХ хроматограммы можно полагать, что анализируемые продукты состоят из смеси фракций относящихся к двум разным типам соединений. Так как, первая фракция одновременно фиксируется и по рефрактометру (кривые а и а^ᴵ, пики 1) и по УФ-детектору носящий мультиплетный характер с пяти максимумами и с разными интенсивностями (кривая б,пики 1-5). Это свидетельствует о наличии в ее составе пяти под фракций разной функциональности, хорошо поглощающих в УФ области . Индивидуальный характер сигнала фракций по рефрактометру связано с близостью физико-химических параметров, особенно оптических плотностей соединений имеющихся в ее составе. По результатам физико–химических анализов установлено их соответствие к полиацетиленовым соединениям (ПА) обладающих высокой степенью ненасыщенности, содержащих многочисленные тройные, а также двойные связи, т.е. активных хромофорных групп хорошо поглощающих в УФ области. А остальные 4 фракции фиксируются только по рефрактометру и относятся к хорошо растворимым в воде полисахаридам (ПС), в составе которых основными функциональными группами являются ауксохромные гидроксильные группы не поглощающих в УФ-области (кривая а, пики 2-5). По характеру хроматограмм видно также, что в эфирных экстрактах, как и следовало ожидать, количественным преимуществом обладают ПА (кривая а), а в водных экстрактах ПС (кривая а^ᴵ). В обоих случаях количество ПА и ПС выделенных из состава биомасс соответствующих базидиомицетов достигалось 70-80%.

Изучение ММР экстрактов методом ЭЖХ позволило установить количественное соотношение отдельных фракций в их составе. Выявлены оптимальные условия максимального перехода, обеспечивающего ПА и ПС из культуральной жидкости в МЭ и воду. Например, содержание ПА в МЭ экстракте достигает до ~70% (Ganoderma lucidum) а количество олигосахаридов в этом случае достигает лишь до ~10%. А в случае водных экстрактов обнаруживается обратное, т.е. фиксируется лишь 6% фракции ПА а до 80% фракции ПС с разными значениями M_n (таблица). Причем полиацетилены проявленные по рефрактометру, как и в случае ОФАЖХ, характеризуются узким пиком с максимумом при V_R=15.5 соответствующей M_n=180 (рис.2, кривая а ) . ЭЖХ анализ подтвердил также полимерную структуры следующих фракций. Так пики 2-5 (рис.2, кривая а) на ЭЖХ хроматограмме исследуемых экстрактов, с максимумами при V_R=9.8 и 10.2, соответствуют к полисахаридам с M_n= 4500 и 3600 (10% и 11.5%), а при V_R = 12 и 13 к фракциям олигосахаридов с M_n= 1260 (гептаоза) (31%) и 1080 (тетраоза) (41.5%). Как следует из представленных данных в таблице изменение ММ указанных фракций, в таком широком диапазоне, также отражаются в значениях степени полидисперсности (СП). Причем суммарные значения СП МЭ экстрактов довольно высокие (3.62 и 3.5) (таблица, фракции 7 и 14) чем водные экстракты (1.82 и 2.02) (фракции, 6 и 13). Исследуемая хроматографическая система позволяет выделить фракции из состава экстрактов со значением СП в довольно низком интервале 1.0-1.2. Из табличных данных также видно, что в обоих случаях, при использовании базидиомицетов рода Ganoderma lucidum и Pleurotus ostreatus, наблюдаются идентичные закономерности, фиксируется лишь небольшая разница в количественных соотношениях фракций в составе исследуемых экстрактов. Это свидетельствует о том, что в подобранных условиях выращивания биомасс исследуемых базидиальных грибов, механизм их действия одинаков. Сравнение УФ- хроматограмм снятых в ЭЖХ и ОФАЖХ режимах показывает, что в последнем случае селективность системы по функциональности ПА соединений гораздо высокая. Так, мультиплетные сигналы фракции ПА, зафиксированных в случае ОФАЖХ (рис.1, кривая б и б^ı) в ЭЖХ режиме отличаются мономодальностью (рис.2, кривая б и б^ı).

С целью изучения химического состава обнаруживаемые фракции ПА подвергнуты препаративному разделению. Оно было обеспечено в условиях повышенной концентрации экстракта, многократным сбором фракции по соответствующим пикам ОФАЖХ, зафиксированных по УФ-детектору, которые далее были подвергнуты структурному анализу [2]. В результате проводимых исследований по изучению химического состава и структуры смесей ПА, выращиваемых базидиальными грибами были идентифицированы 5 известных соединений следующей структуры соответственно по пикам 1-5 (рис.1, кривая б). Указанные соединения были зафиксированы последовательно в следующем порядке:

1 - цис-ундека-3,9,10-триен-5,7-дииновая кислота – H₂C=C=CH-CΞC-CΞC-CH=CH-CH₂-COOH;

2 - цис-ундека-2-ене-4,6,10-трииновая кислота – HCΞC-CН₂-CH₂-CΞC-CΞC-CH=CH₂-COOH;

3 - цис-нона-4-ене-6,8-дииновая кислота - HCΞC-CΞC-CH=CH-CH₂-CH₂-COOH;

4 - цис-ундека-3-ене-5,7,10-триин-1-ол- HCΞC-CH₂-CΞC-CΞC-CH=CH-CH₂-CH₂OH;

5 - дека-цис-2-транс-8-диен-4,6 диин-1-ол- CH₃-CH=CH-CΞC-CΞC-CH=CH-CH₂OH.

Результаты ВЭЖХ исследований по изучению процесса биосинтеза выявляет возможности различного рода базидиомицетов, встречаемых в лесах Азербайджана, кроме ПС и ПА, cинтезировать многих других биологически активных органических веществ медицинского назначения. Кроме того разработанное хроматографическое условие позволяет осуществить контроль за

условиями культивирования, последовательно за составом и структурой продуктов биосинтеза, а также за эффективностью действия различных грибов в отдельности. Была разработана методика получения ПС и ПА и выявлены факторы регулирующие их соотношения.

ЛИТЕРАТУРА

1. Караюсифова А.К., Гахраманова А.К., Ягубова Г.Г., Мурадов П.З. Видовой состав и некоторые особенности ксилотрофных макромицетов распространенных в условиях Азербайджана // Вестник МГОУ, серия «Естественные науки», 2011. №1. С.25-29

2. Мурадов П.З., Алиев И.А., Аббасова Д.М. Изучение морфо- физиологических характеристик некоторых базидиальных грибов, имеющих медицинское значение // Вестник МГОУ, серия «Естественные науки», 2009. №2. С.57-60

3. Алиева С.Р., Велиев М.Г., Исмаилов Э.И., Ягубова Г.Г., Мурадов П.З. Биосинтез полиацетиленовых соединений базидиальными грибами // Журнал иммунопатология, аллергология, инфектология, 2009, №2, С.158-159

4. Белова Н.В. Базидиомицеты–источники биологических активных веществ // Растительные ресурсы, 1991. т.27. №2. С.8-17.

5. Хроматография /под ред.Э.Хефтмана.М.: Мир,1986. 422с.

6. Мамедьяров М.А., Бабаева И.Х., Касумова С.Ю., Велиев М.Г., Бекташи Н.Р. Микробное окисление нафталановой лечебной нефти // Доклады Национальный Академии Наук Азербайджана, Микробиология, 2005. т.61. №1. С.121-128

7. Атакишиева Я.Ю., Исаева К.Х., Бекташи Н.Р., Велиев М.Г. Исследование гиббереллинов синтезируемых микромицетами // Изв.НАН Азербайджана, сер.биол.науки, 2009. № 3-4. С.135-138.

8. Бекташи Н.Р.,Джафаров В.А. Высокоэффективная эксклюзионная хроматография полифункциональных эписульфидсодержащих олигомеров // Высокомолек.соед. 2004. А. т.46. № 12, С.2028-2034

HPLC STUDY OF POLYSACCHARIDES AND POLYACETYLENES PREPARED IN THE BIOSYNTHESIS PROCESS BY BASIDIOMYCETES

N.R.Bektashi

Oil Gas Scientific Research Project Institute,

88a H. Zardabi avenue, Baku, Azerbaijan, AZ1012

By the methods of two-detector HPLC, exactly, the exclusion and reversed-phase adsorption liquid chromatography the control of biosynthesis process of polysaccharides and polyacetylene compounds by basidiomycetes of genus of Ganoderma lucidum and Pleurotus ostreatus spreading in the forests of various ecological territories of Azerbaijan has been carried out. During growing of these fungi under the conditions of submerged cultivation in composition of their mycelium 4 fractions of polysaccharides with different parameters of MWD and 5 fractions of polyacetylene compounds conjugated by unsaturated bonds with various functionality have been isolated and identified. The factors regulating their ratios have been revealed.

Key words: basidiomycetes, exclusion chromatography, reversed-phase adsorption liquid chromatography, polysaccharides, polyacetylenes

Рис.1 ОФАЖХ кривые смеси ПА и ПС полученных в процессе биосинтеза базидиальными грибами рода Ganoderma lucidum, выделенных при экстракции метиловым эфиром (кривые а и б) и водой (кривые а^ı и б^ı). Адсорбент ”Separon SGX C18”, элюент ацетонитрил+Н₂О(75+25 об.%), Т=20-25⁰С. Здесь и на рис.2 детекторы: рефрактометрический (сплошная линия), УФ-спектрофотометрический (254 нм) (штриховая линия).

Рис.2 Эксклюзионные кривые ММР смеси ПА и ПС полученных в процессе биосинтеза базидиальными грибами рода Ganoderma lucidum, выделенных при экстракции метиловым эфиром (кривые а и б) и водой (кривые а^ı и б^ı). Адсорбент ”Separon SGX”, D=100 Å, элюент ДМФА - 0.3 мл/мин, Т=20-25⁰С, 1сч=0,13мл.

Таблица. Молекулярно-массовые характеристики ПА и ПС полученные в процессе биосинтеза базидиомицетами Ganoderma licidum (фракции 1-7) и Pleurotus ostreatus (фракции 8-14).V_R= C₁- C₂lgM, С₁=24.4, С₂= 4.0

№, Фракции	Название фракции	Содержании фракции,%		ММР		Мw/Мn	VR max	ММ VR max
				МW	Мn
		В МЭ	В воде
1 2 3 4 5 6^* 7^* 8 9 10 11 12 13^* 14^*	ПА Гексаоза Гептаоза Олигосахарид Олигосахарид --- --- ПА Гексаоза Гептаоза Олигосахарид Олигосахарид --- ---	74 11 18 3.0 4.0 - - 71 12 7.0 5.0 5.0 - -	6.0 42.5 31 11.5 10 - - 8.0 40 33 12 7.0 - -	180 1085 1260 4390 5450 1912 829 180 1085 1260 4600 5600 1806 855	180 1085 1260 3600 4500 1260 229 180 1085 1260 3500 4650 893 244	1.0 1.0 1.0 1.22 1.21 1.82 3.62 1.0 1.0 1.0 1.31 1.2 2.02 3.5	15.35 13.1 12.15 10.86 9.7 - - 15.35 13.1 12.15 10.5 10.0 - -	180 1085 1260 2430 4730 - - 180 1085 1260 2985 4000 - -
*суммарные ММ продукта в водном (6и7) и в МЭ экстракте (13,14).