Медицина. Інфекційні хвороби
Дуднік С.В., Варфоломєєва Ю.В., Трюханова Т.І.,
Терещенко В.В.
БАКТЕРІОЛОГІЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ
КРІПТОКОКОЗУ У ХВОРИХ З ВІЛ-ІНФЕКЦІЄЮ
ОКЗ «Криворізька інфекційна лікарня №1»
КЗ «Криворізький протитуберкульозний диспансер №2»
Кріптококовий менінгіт і генералізована кріптококова
інфекція, що розвиваються при глибокому імунодефіциті є маркерними захворюваннями
ВІЛ-інфікованих хворих, які ускладнюють
перебіг основного захворювання і часто закінчуються летально. Важливо у
ВІЛ-інфікованого хворого диференціювати кріптококову інфекцію від туберкульозу,
неоплазмозу, кокцидіоідозу, гістоплазмозу, кандидозу, вірусного менінгіту і
саркоідозу. Своєчасне виявлення кріптококозу
в умовах відсутності деяких спеціалізованих поживних середовищ та початок
антимікотичного лікування є актуальним та визначає важливість вивчення методів
діагностики кріптококозу у повсякденній практиці клініко-діагностичної
лабораторії [3].
Збудником кріптококозу є умовно-патогенний дріжджоподібний
грибок Cryptococcus neoformans роду Cryptococcus.
Клітини кріптококу мають круглу або овальну
форму від 3 до 20 мкм у діаметрі з єдиною дочірньою брунькою, з¢єднаною
з материнською клітиною тонким перешийком. Материнська і дочірня клітини вкриті
мукополісахаридною капсулою, яка іноді досягає товщини 50-60 мкм та може дорівнювати
двом діаметрам самої кріптококової
клітини. Полісахаридна капсула є основним фактором патогенності кріптококу, що
сприяє його проникненню,безперешкодному розмноженню та генералізації в
організмі. Полісахарид капсули впливає на клітинний компонент імунітету при
криптококозі: гальмує фагоцитоз криптококів поліморфноядерними лейкоцитами,
знижує їх антикріптококову активність, впливає на активність лізосомальних
ферментів макрофагів [5].
Лабораторна діагностика кріптококозу у людини базується
головним чином на мікроскопічному, культуральному та гістологічному методах
дослідження. Серологічна діагностика актуальна при негативних результатах
культуральних досліджень.
Збудник
кріптококозу здатний вражати будь-які
клітини організму, але відрізняється явною нейротропністю. Основним матеріалом
для дослідження є спинномозкова рідина. Дослідження гнійних виділень, біоптатів
з уражених органів, крові проводять для підтвердження генералізації процесу. Основним методом діагностики є виділення
збудника при мікроскопії або при культивуванні. «Золотим стандартом» підтвердження
діагнозу кріптококозу є виділення збуднику культуральним методом. Кріптококи
виділити у культурі досить важко. Маємо обмежений набір середовищ, тому що
відсутнє рекомендоване середовище Штайба, на якому колонії кріптококового гриба
набувають стійкого темно-коричневого кольору [4], морквяно-картопляний
агар, середовище Літтмана,
Чапека-Дорса.
Для виділення чистої культури досліджуваний матеріал
засівають на цукровий агар, середовище Сабуро, пивне сусло з додаванням
антибіотиків. Посіви інкубують при 37 °С, колонії формуються через 3-15 діб. На
щільних середовищах утворюються колонії від білувато-жовтуватого до
темно-коричневого кольору, сметаноподібної консистенції, на
морквяно-картопляному агарі колонії гриба мають темно-коричневе або буре
забарвлення. Ідентифікація С. neoformans проводиться з урахуванням
утворення уреази на середовищі
Хрістеансена і нездатності засвоювати лактозу і неорганічний азот, вірулентності,
росту при 37 °С.
Нами було проведено обстеження ліквору у хворого на СНІД з проявами прогресуючого
менінгоенцефаліту невизначеної етіології. Біохімічний аналіз діагностичної
люмбальної пункції виявив патологічні зміни загального характеру: підвищений рівень білку (0,67 г/л), знижений
рівень глюкози (1,48 ммоль/л), лімфоцитарний цитоз - 40 кл в 3 мкл. Пряма
бактеріоскопія осаду ліквору, забарвленого за Грамом і Буррі не виявила клітин
кріптококу. Посів нативної спинномозкової рідини на пластинчаті поживні
середовищі (кров¢яний агар, рисовий агар) не дав росту через 72 години.
Для мікробіологічного дослідження на кріптококоз ліквор
попередньо центрифугували при 1000 об/хв 15 хв. і осад використали для
приготування препаратів для мікроскопії та засіву на рідке середовище Сабуро і
цукровий бульйон для подальшого пересіву на пластинчаті поживні середовища. Цукровий
бульйон використали як середовище збагачення. На щільні поживні середовища ліквор у кількості 3.0 мл засівали стерильним
шпателем по усій поверхні середовища.
Оцінку культуральних особливостей колоній (колір,
консистенція) проводили після їх вирощування на рисовому агарі при кімнатній
температурі, кров¢яному агарі при 37°С. Інкубація при
37°С дозволяє диференціювати патогенні форми від сапрофітних: С. neoformans
однаково добре росте як при 25°С, так і при 37°С, у той час як сапрофітні
криптококки не здатні розмножуватися при 37°С. Для
вивчення морфологічних характеристик кріптококів використовували метод
мікроскопії у «роздавленій краплі» і у туші. При цьому враховували діаметр
клітин, товщину полісахаридної капсули, інтенсивність брунькування.
А Б В
Мал. 1. Колонії кріптококу
на кров¢яному агарі на 3-тю(А), 6-ту(Б) та 9-ту(В) добу
інкубації.
Після інкубації ліквору у цукровому бульйоні протягом 24
годин при 37°С матеріал засіяли на кров¢яний агар. Через 24 години з¢явився ледь помітний ріст, на 3-тю добу інкубації на кров¢яному агарі при 37°С - колонії
круглі, випуклі, з рівним краєм, гладенькі, блискучі, прозорі, сметановидні,
злегка слизові, схожі на «крапельки роси». Розмір колоній у діаметрі 1-3мм
(мал. 1а). При більш тривалому інкубуванні колонії збільшились у діаметрі,
стали більш мутними, сухими, набули темно-жовтого забарвлення. На 6-ту добу
інкубації розмір колоній досяг 3-4мм
(мал. 1б). На 9-ту добу колонії набули більш коричнево-жовтого відтінку і у діаметрі
досягли 5-6мм (мал. 1в). З виділених
колоній зробили мазки, які фарбували по Буррі з контрастуванням у краплі
туші, методами Грама та Нохта. При фарбуванні по Буррі на злегка сіруватому
фоні туші при мікроскопії препаратів добре видні широкі капсули клітин, що
брунькуються. Виявлення на темному фоні дріжджоподібних клітин з однією
брунькою, які оточені світлим ободком капсули є точним доказом виділення Cryptococcus neoformans [5]. У препаратах з молодих колоній кріптококу чітко визначені великі круглі
клітини гриба з однією маленькою дочірньою брунькою (мал. 2а). В препаратах
більш зрілих колоній гриба дочірні клітини слабо пов¢язані
із материнською клітиною і швидко від них відокремлюються (мал. 2б).
А Б
Мал. 2. Препарати
забарвлені методом Буррі 3-добової (А) і
9-добової (Б) культури кріптококу.
У мазках, забарвлених методом Грама, кріптокок має вигляд
грампозитивних круглих або овальних дріжджоподібних клітин з дочірньою
брунькою, що з¢єднана з материнською клітиною тонким з¢єднанням
(мал. 3а, 3б). У препараті 72-годиної культури кріптококу добре видно маленькі дочірні бруньки, що з¢єднані
з материнською клітиною (мал. 3а). Мазок з культури на 6-й день інкубації на кров¢яному
агарі виявив дочірні бруньки, що збільшились у розмірах. Більш чітко помітне з¢єднання
з материнською клітиною тонкою перетинкою (мал. 3б). У препараті культури
кріптококу після 9-ти днів інкубації на кров¢яному
агарі, дочірні клітини не спостерігаємо, тому що з¢єднання
дріжджової клітини зі своїм нащадком ненадійне і дочірня клітина швидко
відокремлюється від материнської.
А Б В
Мал. 3. Клітини кріптококу
у препаратах забарвлених за Грамом 3-денної культури (А), 6-денної (Б) і
9-денної (В) культури, вирощеної на кров¢яному агарі.
Мал. 4. Препарат культури кріптококу, вирощеного
на рисовому агарі. Забарвлення методом Нохта.
З рідкого середовища Сабуро висів бульйонної культури
проводили на рисовий агар. На рисовому агарі молоді колонії кріптококу білі, круглі,
випуклі, з рівними краєм та поверхнею, сметановидні, розміром 1-3мм у діаметрі
(мал. 5а). Із збільшенням терміну інкубації колонії ставали більш мутними,
сухими, збільшувались у діаметрі до 6мм (мал. 5б).
А Б
Мал.5. Колонії кріптококу
на рисовому агарі на 6-ту (А) та 9-ту (Б) добу інкубації.
Вивчали біохімічні властивості виділеної культури
кріптококу: не проферментованими залишилися глюкоза, сахароза, лактоза,
мальтоза, на середовищі Хрістенсена
утворилась уреаза. Виявлена чутливість
культури кріптококу
до флуконазолу.
Таким чином, незважаючи на обмежений набір необхідних
поживних середовищ для дослідження на кріптококоз і враховуючи більш важке
виділення мікроміцетів роду Cryptococcus у порівнянні з грибами роду Candida, у клініко-діагностичній лабораторії маємо можливість виділити кріптокок з
патологічного матеріалу, завдяки доступним методикам. Своєчасна діагностика
кріптококозу як етіологічного чинника гострої і хронічної неврологічної
патології, особливо у ВІЛ-інфікованих хворих, важлива для диференціювання кріптококового
менінгіту з менінгітами і менінгоенцефалітами іншої етіології та негайної
корекції лікування в умовах прогресуючого захворювання.
Література:
1.
Білько І.П. Мікологія глибоких мікозів і псевдо мікозів у
людини. – Севастополь.: Рібест. – 2007, 72с.
2.
Васильева
Н.В., Степанова А.А., Филиппова Л.В. Особенности взаимодействия Cryptococcus neoformans разной вирулентности и
альвеолярных макрофагов // Проблемы медицинской микологии. - №4, Т.13. – 2011,
С.46-50.
3.
Карнаухова О.Г., Платонова Т.А., Верещагина С.А. Лабораторное
подтверждение криптококкоза у ВИЧ-инфицированных пациентов в Иркутске //
Сибирский медицинский журнал. – №6. – 2008, С.91-94.
4.
Липницкий А.В., Лесовой В.С., Новицкая И.В. Изучение
возможностей использования агара Штайба в микологических исследованиях //
Успехи медицинской микологии. – Том І. Глава 2, С.73-75.
5.
Лысенко А.Я.,Турьянов М.Х.,Лавдовская М.В.,Подольский
В.М. ВИЧ – инфекция и СПИД – ассоциируемые заболевания //Москва – 1996г.,623с.