Біологічні науки. Мікробіологія

студент Пащенко К.А., доцент, к.б.н. Волошина О.С.

Національний університет харчових технологій, Україна

Біоутилізація гліцерину генно-модифікованим штамом
E. coli

Збільшення вартості транспорту різних видів палива, зростання проблем пов'язаних з екологією у поєднанні зі зменшенням запасів нафти, збільшили акцент на пошук альтернативних джерела енергії. Одним з перспективних поновлюваних видів палива є біодизель, але суттєвим недоліком є висока вартість його виробництва.

Гліцерин, як побічний продукт одержання біодизельного палива, у значних масштабах потрапляє в навколишнє середовище, стає причиною його забруднення. Переробка технічного гліцерину з метою подальшого використання, може стати одним з шляхів зниження вартості виробництва біодизелю. Тому в даний час ведуться інтенсивні пошуки способів переробки технічного гліцерину в більш цінні продукти.

1,3-пропандіол є одним з важливих продуктів, що використовуються в хімічній промисловості, зокрема для виробництва поліефірів. Використання сирого гліцерину для виробництва 1,3-пропандіолу є хорошим рішенням як з

економічної, так і екологічної точки зору. Мікробіологічним шляхом гліцерин

перетворюють в 1,3-пропандіол, бактерії таких родин Сitrobacter, Klebsiella, Lactobacillus, Enterobacter і Clostridium, Citrobacter freundii, Pelobacter carbinolicus, Rautella planticola, Bacillus welchii, Escherichia coli [1].

Для створення біотехнологічного виробництва 1,3-пропандіолу необхідно вирішити три завдання:

- пригнічення синтезу побічних продуктів, що накопичуються в культуральній рідині і знижують вихід 1,3-пропандіолу;

- виключення з процесу економічно невигідний кофактор вітамін В₁₂ ;

- знаходження не патогенного штаму мікроорганізму.

Для створення рекомбінантного штаму E. сoli були використані гени наступних штамів мікроорганізмів:

- Clostridium butyricum SYU 20108, з Південного університету Янцзи культурного центру мікроорганізмів;

- дикого типу E. сoli штаму SYU 21132;

- Е.coli К- 12 ER2925, отриманий з лабораторії Нової Англії Bio-Labs, що використали в якості господаря для гетерологічної експресії оперону [3].

Плазмідну ДНК E. coli отримували за допомогою швидкої процедури лужного лізису. Секвенування ДНК обох ланцюгів було виконано на автоматичному секвенаторі ABI 373 з барвником позначених термінаторів. Геномну ДНК з С.butyricum виділяють у відповідності зі способом Marmur [4].

В результаті досліджень для біотехнологічного виробництва 1,3-пропандіолу:

- було створено рекомбінантний штам E.coli де використана гетерологічна експресія оперону, в якому поєднані гени двох різних механізмів синтезу 1,3-пропандіолу з гліцерину;

- щоб уникнути використання економічно невигідного кофактора вітаміну В₁₂, обрали гени dhaB1 і dhaB2, виділені з С. butyricum, що кодують вітамін В₁₂- незалежну гліцериндегідратазу і фактор його активації;

- для зменшення накопичення 3-гідроксипропіональдегіу, що є інгібітором синтезу 1,3-пропандіолу, використали ген yqhD, який кодує 1,3-пропандіол НАДФ-залежну дегідрогеназу.

Вперше у промисловому масштабі був використаний вектор pBV220 чутливий до температури, який проводить експресію генів від фага λ до промотора PLPR, при передачі клітин за температури 42 ºС. Плазміда також містить ген cIts875, що кодує регулювання чутливих до температури білків [4].

В якості господаря для створення інженерного штаму було використано E. coli K-12, який має деякі переваги:

- не патогенний для людини, на відміну від деяких природних штамів;

- високу швидкість росту, що є перспективним для скорочення процесу бродіння;

- за допомогою генної інженерії створити єдиний шлях синтезу
1,3-пропандіолу, в якому буде зменшений синтез 3-гідроксипропіональдегіду, що є інгібітором.

Для перевірки ефективності створено штаму було використано двоступеневе культивування, що сприяло зменшення утворення побічних продуктів та зменшення часу бродіння [3].

Під час першого етапу (8-10 год.) культуру вирощували в середовищі з безперервною подачею глюкози (концентрація 25 г/л), в присутності розчиненого кисню та мікроелементів. Щільність клітин станови 26 г/л (суха речовина).

На другому етапі замість глюкози додали гліцерин та проводили ферментацію протягом 2 годин, температура культивування складала 42 °С. недоліком є те, що не можливо було уникнути утворення побічних продуктів таких як піруват та ацетат, які пригнічують синтез 1,3-пропандіолу [4].

Вирощування рекомбінантної культури в анаеробних умовах сприяло підвищенню синтезу 1,3-пропандіолу, як кінцевого продукту ферментації без пригнічення побічними продуктами. Час культивування складав 35 годин.

Було виявлено, що з допомогою гену уqhD відбувалось ефективне перетворення 3- гідроксипропіональдегіду на 1,3-пропандіол, та блокування його властивостей, як інгібітора, у порівнянні з природними штамами мікроорганізмів [3].

Найвища ефективність синтезу 1,3-пропандіолу спостерігалось при використанні гліцерину в якості єдиного джерела вуглецю. Зокрема, був досягнутий вихід 1,3-пропандіолу 104,4 г/л, продуктивність 2,61 г/л на годину, а коефіцієнт конверсії гліцерину в 1,3- пропандіол складав 90,2 % (г/г) [2].

У порівнянні з іншими мікроорганізмами, що використовуються в анаеробній ферментації, концентрація 1,3-пропандіолу була значно нижче
70,4 г/л для С. butyricum і від 70 до 78 г/л для Klebsiella pneumoniae. Конверсія гліцерину в 1,3-пропандіол також була значно нижче ніж 1,57 г/л на годину і менше 75 % (г/г) відповідно.

Створення та використання даного штаму є перспективним для переробки технічного гліцерину, що є побічним продуктом при виробництві біопалива і дозволить зменшити витрати на матеріали. Це важливо не тільки економічно, але і для збереження навколишнього середовища [2].

Література:

1. Zhang Y., Huang Z., Du C. Introduction of an NADH regeneration system into Klebsiella oxytoca leads to an enhanced oxidative and reductive metabolism of glycerol // Metab. Eng. – 2009. – V. 11. – P. 101–106.

2. Nakamura C.E., Whited G.M. Metabolic engineering for the microbial production of 1,3-propanediol // Curr. Opin. Biotechnol. – 2003. – № 14. – Р. 454–459.

3. Liu H.J., Zhang D.J., Sun Y.Q. Microbial production of 1,3-propanediol from glycerol by Klebsiella pneumoniae under micro-aerobic conditions up to a pilot scale // Biotechnol. Lett. – 2007. – V. 29. – P. 1281–1285.

4. Xueming T., Yongsong T.,Hong Z. Microbial Conversion of Glycerol to 1,3-propanediol by an Engineered Strain of Escherichia coli // American Society for Microbiology. – 2009. – V. 75. – № 6. – Р. 1628–1634.