Артюгина Л.И., Бондарева А.В., к.мед.н., доцент Багмут И.Ю.,

Полищук Т.В., к.мед.н. Резуненко Ю.К.

Харьковский национальный медицинский университет

ВЛИЯНИЕ ПОЛИОЛОВ НА ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ И БИОЭНЕРГЕТИКУ В ПОДОСТРОМ ОПЫТЕ

Проблема химического загрязнения окружающей среды и рационального использования природных ресурсов является наиболее актуальной. Она занимает ведущее место среди неблагоприятных факторов, которые приводят к развитию экологически обусловленной патологии [1]. Интенсивная разработка и внедрение в производство новых технологических схем, широкий ассортимент продукции, быстрое наращивание производственных мощностей, размещение основных предприятий в густо населенных местах, приводит к неблагоприятным условиям проживания, что сопряжено с формированием различных заболеваний и патологических состояний [2,3]. К веществам, с которыми тесно контактирует население, относятся полиолы - полиэтиленгликоли. Эти соединения широко используются в различных отраслях народного хозяйства как основа промышленного выпуска пластмасс, пенопластов, полиуретанов, искусственной кожи, лаков, эмалей, эпоксидных смол и др. [4,5]. К числу неизученных и высокоперспективных в народнохозяйственном отношении веществам относятся полиолы: полиоксипропиленоксиэтиленгликольуретан (ПГ-100) и полиоксипропили-рованный амин (ПА-294). Отсутствие в научной литературе сведений о потенциальной опасности этих соединений для теплокровных животных и человека, обосновывает необходимость изучения механизмов биологического действия и составления прогноза формирования возможных патологических процессов в условиях субтоксического воздействия их на организм теплокровных животных.

В этой связи актуальным являлось изучение влияния новых химических соединений на метаболические процессы и обоснование патогенетической коррекции нарушения гомеостатической функции организма.

Целью работы являлось изучения влияния субтоксических доз ПГ-100 и ПА-294 в условиях подострого эксперимента на окислительно-восстановительные и энергетические процессы.

Материалы и методы исследования. В работе была использована новая группа полиолов с регламентированными физико-химическими свойствами: полиоксипропиленоксиэтиленгликольуретан (ПГ-100) и полиоксипропилиро-ванный амин (ПА-294). На основании результатов острого опыта на белых крысах эти вещества относятся к малотоксичным соединениям (4 класс опасности). Их среднесмертельные дозы (ДЛ₅₀) были установлены на уровнях 15,4 и 13.9 г/кг массы животного, соответственно для ПГ-100 и ПА-294. Выбор соответствующей группы ксенобиотиков был обоснован отсутствием сведений в научной литературе о механизмах их биологического действия и необходимостью получения прогностической характеристики потенциальной опасности полиолов для теплокровных животных и человека. Программа исследования предусматривала проведение подострого опыта на половозрелых белых крысах популяции Вистар (массой 180-200г). В соответствии с условиями эксперимента опытным животным на протяжении 45 суток ежедневно утром натощак, с помощью металлического зонда перорально вводились водные растворы веществ в дозах 1/100 и 1/1000 ДЛ₅₀. Контрольная группа крыс получала соответствующие объемы питьевой воды. В эксперименте было использовано 50 белых крыс при соблюдении биоэтики и принципов «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются для научных и других целей» (Страсбург, 1985 г.). По окончанию подострого опыта определялось состояние тканевого дыхания, окислительного фосфорилирования, содержание неорганического фосфата , АМФ, АДФ, АТФ, циклического аденозинмонофосфата (цАМФ), циклического гуанозинмоно-фосфата (цГМФ), малонового диальдегида (МДА), диеновых конъюгатов (ДК), активности каталазы, и супероксиддисмутазы (СОД).

Для оценки дыхания митохондрий и окислительного фосфорилирования, полярографически определяли скорость потребления кислорода в присутствии акцептора (V3). В этом метаболическом состоянии митохондрии содержится избыток субстрата окисления и АДФ, что сопряжено с наибольшей интенсивностью их дыхания. На следующем этапе исследовалось потребление кислорода митохондриями после добавления сукцината (V4), а также после исчерпания добавляемого АДФ в присутствии разобщителя- 2,4-динитрофенола (2,4-ДНФ)-метаболическое состояние (V4'), которое характеризуется дефицитом только АДФ. Это метаболическое состояние называют контролируемым и характеризуется низкой интенсивностью дыхания. При этом рассчитывали:- отношение АДФ/О_2, дыхательный коэффициент (ДК) Ларди и активность АТФ-гидролазных реакций. В качестве субстрата окисления использовали сукцинат [6]. Определение Са²⁺,Мg²⁺зависимой АТФ-азы в гепатоцитах осуществлялось общепринятым методом [7]. Содержание АТФ в тканях печени определялось по методу E. Beutler [8], АДФ по методу D. Jaworek [9], креатинфосфата по методу E.Д. Сонина [10] и неорганического фосфата по методу, описанному Н.П. Мешковой и С.Е. Севериным [7]. Величину значения энергетического потенциала (ЭП) вычисляли по формуле D.E. Atrinson [11]. Содержание цАМФ и цГМФ в печени определяли по A. Steiner [12]. Состояние антиоксидантной системы оценивали по содержанию в печени и сыворотке крови МДА, ДК и активности каталазы, ЦП, СОД. Содержание МДА, ДК определяли по методу описанному Ю.А. Владимировым и А.И. Арчаковым [13]. Активность каталазы оценивалась по методу основанному на способности двух молекул Н₂О₂ разлагаться каталазой на 2Н₂О и О₂ [14]. COД определялась по методу описанному О.С. Брусовым, А.М. Герасимовым и Л.Ф. Панченко[15]. Церулоплазмин исследовался по методу Раввина, описанному В.Г. Колбом и В.С. Камышниковым [16]. Полученные результаты обрабатывались методом вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента-Фишера.

Результаты исследования и их обсуждение. Изучение состояния ОВП у животных, подвергавшихся воздействию полиолами обнаружило активацию перекисного окисления липидов у групп токсифицированных 1/100 ДЛ₅₀. Так в печени выявлено повышение содержания МДА на 252,4% и 267,8 %, активности СОД на 349,46% и 369,8 %, каталазы на 119,6 и 98,68%, соответственно у животных затравленных ПГ-100 и ПА-294 (табл. 1). В сыворотке крови отмечалось увеличение МДА на 177,5 % и 200,0 %, церулоплазмина на 89,7 и 82,4%, ДК на 83,6 % и 100,38, каталазы на 129,07 % и 171,85 %, СОД на 45,94 % и 70,27 %, соответственно под влиянием ПГ-100 и ПА-294. Вещества в 1/1000 ДЛ₅₀ не влияли на динамику исследуемых показателей. Исследования свидетельствуют, что ксенобиотики в 1/100 ДЛ₅₀ усиливают свободнорадикальные процессы, перекисное окисление липидов, активируют ферментативную систему антирадикальной и антиперекисной защиты на фоне усиления продукции острофазных белков о чем указывает повышение уровня церулоплазмина в сыворотке крови.

Таблица 1.

Влияние полиолов на состояние антиоксидантной системы в подостром опыте

Показатели, ткань	Вещества, М ±m, ДЛ50
	Контроль	ПГ-100		ПА-294
	(п=10)	1/100 (п=10)	1/1000 (п=10)	1/100 (п=10)	1/1000 (п=10)
МДА (мкмоль/кг), печень	50,65±4,27	178,5±9,26*	55,26±6,14	186,3±10,5*	48,35±4,73
МДА (мкмоль/л), сыворотка	4,9±0,43	13,6±0,92*	5,21±0,53	14,7±1,15*	5,38±0,46
Церулоплазмин (мг/л), сыворотка	382,3±22,5	725,6±38,4*	406,7±32,8	697,4±25,3*	417,5±27,8
Диеновые конъюгаты (мкмоль/л), сыворотка	26,3±2,57	48,3±3,6*	31,46±3,84	52,7±4,2*	30,65±2,94
Каталаза (ед.акт),печень	7,65±0,48	16,8±1,24*	8,10±0,66	15,2±1,36*	7,92±0,78
СОД (ед.акт.),печень	1,88±0,16	8,45±0,92*	2,16±0,24	9,34±0,87*	1,73±0,16
Каталаза (мккат/г Нв), сыворотка крови	5,4±0,36	12,37±1,25*	5,82±0,47	14,68±1,38*	5,33±0,44
СОД (мккат/гНв), сыворотка крови	0,37±0,08	0,54±0,07*	0,35±0,09	0,69±0,09*	0,36±0,07

Примечание:* различия достоверные, р<0,05

Влияние полиолов на энергетический обмен обнаружило увеличение в печени содержания АМФ, неорганического фосфата, цАМФ и снижение АТФ, АДФ, цГМФ, суммарного количества адениновых нуклеотидов, креатинфосфата и энергетического потенциала (табл. 2).

Таблица 2.

Влияние полиолов на энергетический обмен белых крыс в подостром опыте

Показатели	Вещества, М±m, ДЛ50
	Контроль (n=10)	ПГ-100		ПА-294
		1/100 (n=10)	1/1000 (n=10)	1/100 (n=10)	1/1000 (n=10)
АТФ (мкмоль/г печени)	2,20±0,07	0,68±0,05*	2,22±0,14	0,71±0,09*	2,19±0,18
АДФ (мкмоль/г печени)	1,17±0,08	0,47±0,04*	1,14±0,09	0,55±0,07*	1,16±0,10
АМФ (мкмоль/г печени)	0,80±0,04	1,42±0,07*	0,78±0,05	1,37±0,08*	0,75±0,06
Неорганический фосфор (мкмоль/г печени)	6,31±0,52	9,46±0,63*	6,25±0,44	9,65±0,74*	6,53±0,47
цАМФ (нмоль/г печени)	640,53±28,34	882,4±35,7*	650,7±31,2	893,6±41,8*	649,5±43,5
цГМФ (нмоль/г печени)	36,3±4,8	20,7±1,65*	38,46±3,75	19,85±1,46*	35,4±2,78
Сумма адениновых нуклеотидов (мкмоль/г печени)	4,17±0,06	2,57±0,05*	4,14±0,09	2,63±0,08*	4,10±0,11
Креатинфосфат (мкмоль/г печени)	1,22±0,08	0,47±0,04*	1,20±0,11	0,51±0,03*	1,18±0,13
Энергетический потенциал АТФ+1/2АДФ/ АТФ+АДФ+АМФ	0,66±0,04	0,35±0,04*	0,67±0,09	0,37±0,06*	0,67±0,08

Примечание:* различия достоверные, р<0,05

Анализ показал повышение в печени АМФ на 77,5 % и 71,25%, неорганического фосфата на 49,9 % и 52,93 %, цАМФ на 37,7 % и 39,5 % под влиянием 1/100 ДЛ₅₀, соответственно у групп животных токсифицированных ПГ-100 и ПА-294. На этом фоне наблюдалось снижение АТФ на 69,1 % и 67,73 %, АДФ на 59,83 % и 53 %, цГМФ на 43 % и 45,32 % адениновых нуклеотидов на 38,37 % и 32,94 %, креатинфосфата на 61,48 % и 58,20 %, энергетического потенциала 46,97 % и 43,94 % у животных подвергавшихся воздействию, соответственно ПГ-100 и ПА-294. Исследования показывают, что полиолы в 1/100 ДЛ₅₀ существенно ингибируют в печени биоэнергетические процессы и восстановительные синтезы, которые сопряжены с усилением катаболических процессов.

Результаты изучения метаболической активности митохондрий гепатоцитов выявили ингибирование дыхания и окислительного фосфорилирования у групп животных подвергавшихся 1/100 ДЛ₅₀. Доза 1/1000 ДЛ₅₀ не оказывала воздействие на показатели тканевого дыхания и фосфорилирования (табл. 3).

Таблица 3

Влияние полиолов в подостром опыте на метаболическую активность митохондрий

Показатели	Вещества, М±m, ДЛ50
	Контроль (n=10)	ПГ-100		ПА-294
		1/100 (n=10)	1/1000 (n=10)	1/100 (n=10)	1/1000 (n=10)
Дыхание митахондрий после добавления сукцината (V4), (нмоль О2/мин×мг белка)	1,78±0,27	1,20±0,11*	1,73±0,25	1,28±0,08*	1,70±0,18
Дыхание после добавления АДФ(V3), (нмоль О2/мин×мг белка)	6,2±0,48	3,20±0,24*	6,42±0,37	3,15±0,32*	6,37±0,43
Дыхание после добавления разобщителя 2,4 ДНФ (V4'), (нмоль О2/мин×мг белка)	7,42±0,64	3,85±0,33*	7,65±0,43	3,67±0,28*	7,54±0,58
Дыхательный коэффициент (ДК=V3/V4,отн.ед)	3,48±0,37	2,66±0,17*	3,71±0,31	2,46±0,20*	3,74±0,30
Коэффициент фосфорилирования ( АДФ/О2)	2,84±0,32	1,26±0,13*	3,15±0,32	1,32±0,09*	2,68±0,25
Mg^2+-АТФ-аза (мкмоль Р/мг белка×час)	83,26±5,17	52,30±4,27*	82,65±6,14	51,84±3,97*	86,23±6,38
Са^2+-АТФ-аза (мкмоль Р/мг белка×час)	71,40±4,23	43,62±3,76*	69,23±4,38	41,73±4,26*	70,56±4,73
Н^+-АТФ-аза (мкмоль Р/мг белка×час)	76,52±3,86	39,74±4,23*	74,65±6,12	41,56±3,72*	73,84±5,96

Примечание:* - различия достоверные, р<0,05

Так, доза полиолов 1/100 ДЛ₅₀ снижала дыхание митохондрий после добавления сукцината (V4), АДФ (V3) и при внесении разобщителя 2,4 –ДНФ. Дыхательный коэффициент снижался по сравнению с контрольной группой на 25,57 % 29,32 %, а коэффициент фосфорилирования на 55,64 % и 53,53 %, соответственно под воздействием ПГ-100 и ПА-294. На этом фоне отмечалось снижение активности Mg²⁺-АТФ-азы, Са²⁺-АТФ-азы и Н⁺-АТФ-азы. Анализ метаболической активности митохондрий свидетельствует, что полиолы в 1/100 ДЛ₅₀ ингибируют дыхание и окислительное фосфорилирование, которые сопровождаются разобщением этих процессов.

Таким образом, результаты позволяют заключить, что полиолы в 1/100

ДЛ₅₀ усиливают свободнорадикальные процессы, перекисное окисление липидов, активируют ферментативную антирадикальную, антиперекисную защиту на фоне повышения продукции острофазных белков и ингибирования тканевого дыхания, окислительного фосфорилирования и биоэнергетического гомеостаза. В 1/1000 ДЛ₅₀ полиолы ПГ-100 и ПА-294 не оказывают воздействие на метаболические процессы теплокровных животных.

Литература:

1.Цыганенко А.Я., Жуков В.И., Щербань Н.Г., Евдокимов В.И. Научные основы обоснования прогноза потенциальной опасности детергентов в связи с регламентацией в воде водоемов. - Белгород, 2001.- 422 с.

2.Жуков В.И., Кратенко Р.И., Резуненко Ю.К., Зайцева О.В., Мясоедов В.В. и др. Медико-биологические аспекты проблемы охраны водных объектов от загрязнения поверхностно-активными веществами.- Харьков: Торнадо, 2000. – 394 с.

3.Жуков В.И., Стеценко С.А., Пивень В.И., Мясоедов В.В. и др. Биологическая активность детергентов – производных нонилбензолов в связи с проблемой охраны водных объектов. – Белгород: «Белвитамины». - 2000. – 237 с.

4.Жуков В.И., Мясоедов В.В, Стеценко С.А., Козин Ю.И. и др. Эколого-гигиеническая характеристика азотсодержащих поверхностно-активных веществ как загрязнителей водоемов. – Харьков: «Торнадо», 2000. – 180 с.

5.Цыганенко А.Я., Шаповал Л.Г., Зовский В.Н., Щербань Н.Г., и др. Эколого-гигиеническая характеристика детергентов на основе алкилфенолов, изозонилфенолов и вторичных спиртовых фракций С_10-20 как загрязнителей водоемов. – Белгород: «Белвитамины», 2000. – 170 с.

6.Chance D., Williams G.R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation J. kinetics of oxyden utilization. – J. Biol. Chem., 1955, vol. 217, № 1. – P. 383 – 395.

7.Мешкова Н.П., Северин С.Е.. Практикум по биохимии. – М.: МГУ, 1979. – 428 с.

8.Beutler E. Method of enzymatic analysis // New York. – 1975. – vol. 1, № 3. –P. 565-566.

9.Joworek D. Gruber W., Bergmeyer H. U. Adenosin – 5 – diphosphat and Adenosin – 5 – monophosphate // Jn: Bergmeyer H.V. (ed). Meethoden der enzymatishen analyse – Bd. P. Wierhheim// Cnemic. – 1974. – S. 2174-2181.

10.Сонин Е.Ф. Основы биохимии мышц. – К.: Изд-во Киевского университета. – 1960. – 181 с.

11.Atrinson D. E. The energy charge of the adenylate pools as a repylatory parameter. Interaction with ofeedback modifiers // Biochemistry. – 1968. –vol. 7, №41. –P. 4030 – 4034.

12.Stener A.L., Wehmann R.E. Parker Ch. W. Radioimmunoassay for measurement of cuclic nucleotides // Advances in cyclic nucleotides research. – Raven Cress. H.J. – 1972. – vol. 2. – P. 51-52.

13.Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. – М.: Наука, 1972. – 236 с.

14.Архипова О.Г. Методы исследования в профпатологии. - М.: Медицина, 1988. – 207 с.

15.Брусов О.С., Герасимов А.М., Панченко Л.Ф., Влияние природных ингибиторов радикальных реакций на автоокисление адреналина // Биол. экспер. биол. и мед. – 1976. - №1. – с.33-35.

16.Колб. В.Г., Камышников В.С. Справочник по клинической биохимии. Изд-во: Беларусь, Минск. -1982. -366 с.